玉米须中具有神经细胞保护的萜类化合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及植物医药技术领域，具体涉及玉米须中具有神经细胞保护的二萜和倍半萜类化合物及其制备方法和在制备神经细胞保护药物中的应用。


背景技术：

2.玉米须(stigma maydis.)为禾本科玉蜀黍属植物。玉米须被《中华人民共和国卫生部药材标准》1985版(一部)收录为常用药材品种，是我国传统的中药材，具有利水渗湿、降糖降脂的作用。玉米须的研究表明其含有多种化学成分，包含黄酮类、甾醇类、萜类、皂苷类、烷烃、多糖、有机酸、氨基酸等成分。
3.本发明所涉及的对映贝壳衫烷型二萜和macrocarpene型倍半萜类化合物是从玉米须中分离得到的，具有很好的神经细胞保护活性。本发明所涉及的对映贝壳衫烷型二萜和macrocarpene型倍半萜类化合物及其活性，迄今为止尚未见有专利或文献报道。


技术实现要素：

4.本发明的首要目的是提供11个玉米须中具有神经细胞保护的萜类化合物，具体为8个对映贝壳衫烷型二萜和3个macrocarpene型倍半萜类化合物，结构如下所示：
[0005][0006]
本发明所述的二萜和倍半萜类化合物的制备包括如下步骤：
[0007]
(1)将干燥的玉米须干燥花柱和柱头用乙醇回流提取；
[0008]
(2)将提取液减压浓缩得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯和正丁醇萃取；
[0009]
(3)乙酸乙酯层和正丁醇层交叉合并后的样品通过硅胶减压柱分离得到流分fr.a～fr.f
[0010]
(4)将fr.b通过反向hp-20和ods柱分离得到fr.b1～fr.b4；
[0011]
(5)将fr.b1通过半制备hplc分离得到化合物1
ꢀ‑
8；
[0012]
(6)将fr.b2通过半制备hplc分离得到化合物9-11。
[0013]
上述制备方法，其中：
[0014]
所述步骤(1)中的乙醇为工业乙醇，其浓度为70-80％；提取次数为2-3次。
[0015]
所述步骤(2)中减压浓缩的温度为55-65℃。
[0016]
所述步骤(3)中减压硅胶柱色谱的梯度洗脱条件为ch2cl
2-meoh＝50:1-1:1。
[0017]
所述步骤(4)中反相hp-20和ods柱的梯度洗脱条件为etoh:h2o＝20:80-100:0。
[0018]
所述步骤(5)中半制备hplc的梯度洗脱条件为ch3cn:h2o＝40:60-60:40。
[0019]
所述步骤(6)中半制备hplc的梯度洗脱条件为ch3cn:h2o＝30:70。
[0020]
所得的化合物1-11经过系统结构鉴定，如图1-29，结果如下：
[0021]
化合物1：白色针状晶体(甲醇)；uv(meoh)λ
max
(logε)204(1.87)；hresims给出准分子离子峰m/z 391.2842[m+h]
+
(calcd for c
24h39
o4,391.2843),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
24h38
o4，计算不饱和度为6。
[0022]
在1h-nmr(600mhz,dmso-d6)中，δ
h 0.98(3h,s,h
3-18),0.76(3h,s,h
3-20),0.88(3h,t,j＝7.4hz,h
3-24)提示存在三个甲基氢信号；δ
h 4.46(1h,s,2-oh)提示存在一个羟基信号；δh3.62(1h,tt,j＝11.9,4.6hz,h-2),3.99(2h,tt,j＝6.6,3.3hz,h-21)为连氧碳上的氢信号；9.63(1h,s,h-19)显示出存在一个醛基基团。
13
c-nmr(150mhz,dmso-d6)谱给出24个碳信号，其中δ
c 205.9(c-19)、176.3(c-17)提示存在一个醛基碳信号和一个酯基碳信号，δ
c 61.5(c-2)、63.5(c-21)提示为两个连氧碳信号。根据上述数据推测化合物1具有ent-kaurane型的二萜骨架。
[0023]
hmbc谱中观察到的h
3-18与c-3/c-4/c-5,h
3-20与c-1/c-5/c-9/c-10的相关，h
2-15与c-8/c-13/c-14/c-16的相关，h-5与c-6/c-7/c-9的相关，h-9与c-11/c-12/c-14/c-20的相关，h-13与c-8/c-15的相关以及h
2-14与c-8/c-12/c-15/c-16的相关，进一步说明了化合物1为ent-kaurane型二萜类化合物。此外，h
2-1与c-2/c-10/c-20的相关以及h
2-3与c-1/c-2/c-4/c-5的相关确定了羟基连接在c-2位。醛基与c-3/c-4存在相关，由此确定了醛基连接在c-4位。h
3-24与c-22/c-23的相关，h
2-23与c-21/c-22的相关以及h
2-21与c-17/c-22/c-23的hmbc相关，确定了长链取代基的存在；h
2-15与c-17的相关确定了长链取代基连接在c-16位。综上，确定了化合物1的平面结构。
[0024]
在noesy谱中，h
3-20与h-2/h-19存在相关，确定了2-oh为β取向、19-cho为α取向；h-1β与h-3β/h-5β相关且h-5β与h-9β相关表明了这些氢原子为β取向；h
3-20与h-14α、h-14β与h-16存在相关表明16位取代基为β取向，因此确定了该化合物的相对构型。
[0025]
通过x单晶衍射技术确定化合物1的绝对构型为2s,4r,5s,8s,9r,10s,13r,16s。同时采用了计算旋光的方法再次验证了其绝对构型。由于16位侧链对于旋光计算影响较小，因此将化合物1简化为1a。化合物1的实测旋光值为-81.0，与1a计算值-64.0接近，故再次验证1的绝对构型为2s,4r,5s,8s,9r,10s,13r,16s。经scifinder检索，其为一个未见文献报
19a),3.17(1h,dd,j＝10.7,4.7hz,h-19b),4.47(1h,t,j＝4.7hz,19-oh)和δ
c 63.9(c-19)提示为一个羟甲基的碳氢信号。δ
h 0.99(3h,s,h
3-18),0.90(3h,s,h
3-20)和δ
c 27.4(c-18),19.0(c-20)提示存在两个甲基的碳氢信号。δ
c 211.0(c-2),176.8(c-17)分别提示为酮羰基和酯羰基的碳信号。δ
h 3.57(3h,s,17-och3)和δ
c 51.5(17-och3)提示为一个甲氧基的碳氢信号。以上基团信号通过hsqc进一步归属。以上的数据与化合物2的数据类似，提示该化合物为一个ent-kaurane型二萜衍生物。
[0036]
hmbc谱中观察到的h
2-1/h
2-3与c-2的相关，确定了酮羰基位于c-2上。h
2-19与c-3/c-4/c-5/c-18的相关确定了羟甲基连接在c-4上。17-och3与c-16/c-17的相关，h-13与c-17的相关，h
2-15与c-17的相关，确定了乙酯基连接在c-16上(fig.2-14)。综上，确定了化合物4的平面结构。
[0037]
该化合物的相对构型是通过noesy确定的。h
2-19与h
3-20存在相关，h-14α与h
3-20存在相关，h-14β与h-16α存在相关，确定了19-ch2oh,16-cooch3分别为α、β取向。
[0038]
通过计算旋光确定化合物4的绝对构型为4r,5s,8s,9r,10s,13r,16s。经scifinder检索，其为一个未见文献报道的新化合物，命名为stigmaydene u。
[0039]
化合物5：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)203(1.16),232(1.03)；hresims给出准分子离子峰347.2219[m+h]
+
(calcd for c
21h31
o4,347.2217),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
21h30
o4，计算不饱和度为7。
[0040]1h-nmr和
13
c-nmr(600/150mhz,dmso-d6)中，δ
h 3.26(1h,dd,j＝10.7,4.7hz,h-19a),3.19(1h,dd,j＝10.7,4.7hz,h-19b),4.48(1h,t,j＝4.7hz,19-oh)和δ
c 63.8(c-19)提示为一个羟甲基的碳氢信号。δ
h 1.01(3h,s,h
3-18),0.96(3h,s,h
3-20)和δ
c 27.2(c-18),19.1(c-20)提示为两个甲基的碳氢信号。δ
h 3.65(3h,s,17-och3)和δ
c 51.2(17-och3)提示为一个甲氧基的碳氢信号。δ
c 210.7(c-2)提示为酮羰基的碳信号。δ
h 6.51(1h,s,h-15)提示为双键上的氢信号，结合碳谱δ
c 152.5(c-15),137.4(c-16),164.5(c-17)提示为一个α,β-不饱和酯基片断。以上基团通过hsqc谱进一步证实。该化合物除了比化合物4结构中多一个双键信号外，其他部分十分类似，因此推测化合物5为一个ent-kaurane二萜类似物。化合物5的hmbc谱数据给出如下相关:h
2-1/h
2-3与c-2；h
2-19与c-3/c-4/c-5/c-18；17-och3与c-16/c-17；h-15与c-7/c-8/c-9/c-13/c-14/c-16/c-17,确定了其平面结构。
[0041]
该化合物的相对构型是通过noesy确定的。h
2-19与h
3-20存在相关，确定了19-ch2oh为α取向。
[0042]
通过计算旋光确定化合物5的绝对构型为4r,5s,8s,9s,10s,13r。经scifinder检索，其为一个未见文献报道的新化合物，命名为stigmaydene v。
[0043]
化合物6：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)203(1.43)；hresims给出准分子离子峰m/z 349.2379[m+h]
+
(calcd for c
21h33
o4,349.2373),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
21h32
o4，计算不饱和度为6。
[0044]1h-nmr和
13
c-nmr(600/150mhz,dmso-d6)中，δ
h 3.63(1h,m,h-2),4.46(1h,d,j＝4.8hz,2-oh)和δ
c 61.5(c-2)提示为一个连羟基的碳氢信号。δ
h 9.64(1h,s,19-cho)和δ
c 206.0(19-cho)提示为一个醛基的碳氢信号。δ
h 0.98(3h,s,h
3-18),0.76(3h,s,h
3-20)和δ
c 23.8(c-18),16.9(c-20)提示为两个甲基的碳氢信号。δ
h 3.57(3h,s,17-och3)和δ
c 51.5
(17-och3)提示为一个甲氧基的碳氢信号。δ
c 176.8(c-17)提示为酯羰基的碳信号。以上基团通过hsqc谱进一步证实。该化合物与化合物1结构非常类似，只是17位的取代基不同，其可以通过hmbc谱中：17-och3与c-17；h-13/h
2-15与c-17的相关证明。
[0045]
该化合物的相对构型是通过noesy确定的。h-2α/19-cho/h-14α与h
3-20存在相关，h-14β与h-16α存在相关，确定了2-oh,19-cho,16-cooch3分别为β、α、β取向。
[0046]
通过计算旋光确定化合物6的绝对构型为2s,4r,5s,8s,9r,10s,13r,16s。经scifinder检索，其为一个未见文献报道的新化合物，命名为stigmaydene w。
[0047]
化合物7：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)204(0.05),225(0.88)；hresims给出准分子离子峰m/z 362.2338[m+h]
+
(calcd for c
21h32
no4,362.2326),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
21h31
no4，计算不饱和度为7。
[0048]
核磁谱图信息显示化合物7与文献中报道的stigmaydene b结构相似，提示区别在于化合物7的17位被氨基取代。氢谱中δ
h 6.85(1h,s,17-nh)和7.25(1h,s,17-nh)证实了氨基的存在。通过noesy相关确定化合物7的相对构型。通过计算旋光确定化合物7的绝对构型为2s,4r,5s,8s,9s,10s,13r。经scifinder检索，其为一个未见文献报道的新化合物，命名为stigmaydene x。
[0049]
化合物8：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)204(1.68)；hresims给出准分子离子峰m/z 369.2024[m+na]
+
(calcd for c
21h30
nao4,369.2036),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
21h30
o4，计算不饱和度为7。
[0050]
化合物8的核磁数据与化合物6相似，区别是化合物8在c-15和c-16位有一个额外的双键，双键的存在可由15位和16位碳的化学位移值δ
c 152.7(c-15)和δ
c 137.3(c-16),以及h-15与c-17,h-13和c-15的hmbc相关确定。
[0051]
化合物8的相对构型由noesy相关确定。通过计算旋光确定了化合物8的绝对构型为2s,4r,5s,8s,9s,10s,13r。
[0052]
化合物9：白色粉末；uv(meoh)λ
max
(logε)203(2.22),218(2.12),288(2.37)；ecd(meoh)225(δε+11.31),246(δε-8.34)；hresims给出准分子离子峰m/z318.1704[m+h]
+
(calcd for c
18h24
no4,318.1700),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
18h23
no4，计算不饱和度为8。
[0053]
在1h-nmr(600mhz,dmso-d6)谱中,δ
h 7.60(2h,d,j＝8.5hz,h-2,6),7.82(2h,d,j＝8.5hz,h-3,5)提示为对位取代的苯环系统上的四个氢信号；δ
h 6.20(1h,ddd,j＝4.4,3.3hz,h-12)为一个烯氢信号；δ
h 0.84(3h,s,h
3-13),0.97(3h,s,h
3-14)提示为两个甲基氢信号；δh3.85(1h,d,j＝7.6hz,h-8),4.74(1h,d,j＝7.6hz,8-oh)，偶合常数相同说明羟基与该次甲基相连；δ
h 8.90(1h,t,j＝5.8hz,15-nh)推测为氮上的氢信号；δ
h 3.66(3h,s,2'-och3)推测为甲氧基氢信号。
[0054]
在
13
c-nmr(150mhz,dmso-d6)谱中，δ
c 125.5(c-2,6),127.1(c-3,5),144.5(c-1),131.3(c-4)提示为苯环上的碳信号；δ
c 137.6(c-7),127.2(c-12)提示为双键的碳信号；δ
c 71.9(c-8)为一个连氧碳信号；δ
c 166.4(c-15),170.5(c-2')分别提示为酰胺和酯基碳信号；δ
c 51.7(2'-och3)为甲氧基碳信号。以上信号进一步通过hsqc谱归属。
[0055]
以上数据与文献中报道的stigmene f相似，也为一个macrocarpene型倍半萜类化
合物。差异在于苯环上的取代基不同，其可以通过hmbc谱中：2'-och3与c-2'，h
2-1'与c-15/c-2'，15-nh与c-15/c-1'，h-3,5与c-15的相关证明。
[0056]
它的绝对构型是通过比较计算和实测ecd来确定的。化合物9的实验cd谱中的cotton效应峰与预设为8r构型的计算ecd谱中的cotton效应峰能够较好的吻合。由此可以确定化合物9的绝对构型分别为8r构型。综上，最终确定了9的结构，经scifinder检索，其为一个未见文献报道的新化合物，命名为stigmene j。
[0057]
化合物10：白色固体；uv(meoh)λ
max
(logε)205(2.24),268(1.92)；ecd(meoh)222(δε+9.56),249(δε-4.86)；hresims给出准分子离子峰m/z 268.1309[m+na]
+
(calcd for c
15h19
nnao2,268.1308),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
15h19
no2，计算不饱和度为7。
[0058]
在1h-nmr(600mhz,dmso-d6)谱中,δ
h 7.55(2h,m,h-2,6),7.81(2h,m,h-3,5)提示为对位取代的苯环系统上的四个氢信号；δ
h 6.17(1h,t,j＝7.6hz,h-12)为一个烯氢信号；δ
h 0.97(3h,s,h
3-13),0.84(3h,s,h
3-14)提示为两个甲基氢信号；δ
h 3.84(1h,d,j＝7.6hz,h-8),4.72(1h,d,j＝7.6hz,8-oh)，偶合常数相同说明-oh与该次甲基相连；δ
h 1.67(1h,ddd,j＝13.1,9.8,6.8hz,h-10),1.20(1h,ddd,j＝13.1,6.2,3.1hz,h-10)推测为一对磁不等同的氢信号；δh2.17(2h,m,h-11)推测为亚甲基氢信号；δ
h 7.91(1h,s,15-nh),7.27(1h,s,15-nh)推测为nh2上的两个氢信号。
[0059]
在
13
c-nmr(150mhz,dmso-d6)谱中,δ
c 167.7(c-15)提示为酰胺上的碳信号；δ
c 125.4(c-2,6),127.3(c-3,5),144.2(c-1),132.0(c-4)提示为苯环上的碳信号；δ
c 137.7(c-7),126.9(c-12)提示为双键的碳信号；δ
c 71.9(c-8)为一个连氧碳信号；δ
c 26.1(c-13),23.8(c-14)为两个甲基碳信号。以上信号进一步通过hsqc谱归属。
[0060]
在hmbc谱中，15-nh2,h-3,5与c-15存在相关，确定了酰胺基团与苯环连接位置；h
3-13与c-8,c-9,c-10,c-14存在相关，h-12与c-7,c-8,c-10,c-11存在相关，h
3-14与c-8,c-9,c-10,c-13存在相关，h-8与c-7,c-9,c-10,c-12存在相关，h-10与c-8,c-9,c-11,c-12,c-13,c-14存在相关，h-11与c-7,c-9,c-10,c-12存在相关，确定了b环结构片断，同时h-8与c-1，h-12与c-1，h-2,6与c-7的相关信号表明a环与b环是通过c-1与c-7相连的，综上，确定了该化合物的平面结构。经查阅文献发现，该化合物为一个macrocarpene型倍半萜类化合物。
[0061]
它的绝对构型是通过比较计算和实测ecd来确定的。化合物10的实验cd谱中的cotton效应峰与预设为8s构型的计算ecd谱中的cotton效应峰能够较好的吻合。由此可以确定化合物10的绝对构型分别为8s构型。综上，最终确定了10的结构，经scifinder检索，其为一个未见文献报道的新化合物，命名为stigmene k。
[0062]
化合物11：黄色油状物；uv(meoh)λ
max
(logε)210(0.20),228(0.26)；ecd(meoh)194(δε+8.53),236(δε-2.97)；hresims给出准分子离子峰m/z 272.1630[m+na]
+
(calcd for c
15h23
nnao2,272.1621),结合1h-nmr、
13
c-nmr推测其分子式为c
15h23
no2，计算不饱和度为5。
[0063]
化合物11的1h-nmr和
13
c-nmr(600/150mhz,dmso-d6)谱数据显示出两个甲基氢信号δ
h 0.87(3h,s,h
3-13)和0.78(3h,s,h
3-14),一个酰胺基氢碳信号δ
h 6.79(1h,s,15-nh),7.20(1h,s,15-nh)和δ
c 169.2(c-15)；两个双键氢碳信号δ
h 6.59(1h,m,h-5),5.33(1h,t,j＝3.7hz,h-12)和δ
c 132.5(c-4),132.7(c-5),142.4(c-7),119.7(c-12)；一个羟次甲基氢
碳信号δ
h 3.37(1h,d,j＝7.2hz,h-8),4.45(1h,d,j＝7.2hz,8-oh)和δ
c 72.4(c-8)。
[0064]
在hmbc谱中，相关信号h3-13与c-8/c-9/c-10/c-14；h3-14与c-8/c-9/c-10/c-13,h-8与c-1/c-7/c-10/c-12；h2-2与c-4/c-6；h-5与c-1/c-3；h-3/h-5与c-15,进一步验证该化合物结构。
[0065]
化合物11具有两个手性中心，由于通过noesy相关无法确定化合物相对构型，所以采用量子化学计算nmr的方式对该化合物的两种构型1s*,8s*-11(11-1)和1r*,8s*-11(11-2)进行了计算来确定化合物的相对构型。
[0066]
两种结构计算碳谱的线性回归方程对应的r2值分别为0.9974和0.9968。结果表明，构象1s*,8s*-11(11-1)的拟合程度更好。根据计算碳谱以及dp4+统计，确定了化合物11的c-1,8位相对构型为1s*,8s*。
[0067]
随后，我们采用量子化学计算的方式，将化合物11的实测ecd与计算ecd相对比，确定了化合物11绝对构型为1r,8r。
[0068]
经scifinder检索，其为一个未见文献报道的新化合物，命名为stigmene l。
[0069]
表1化合物1-6(dmso-d6)的1h(600mhz)nmr数据
[0070]
[0071][0072]
表2化合物7-11(dmso-d6)的1h(600mhz)nmr数据
[0073]
[0074][0075]
表3化合物1-11(dmso-d6)的
13
c(150mhz)nmr数据
[0076]
[0077][0078]
将所得的化合物1-11进行了神经细胞保护活性测试，结果表明化合物4和5在三个浓度下(12.5μm,25μm,50μm)均表现出强于阳性药活性。化合物4和5的ao-eb,hoechst 33258和jc-1染色结果显示化合物4和化合物5能够减轻h2o2诱导的sh-sy5y细胞凋亡和线粒体功能障碍。因此本发明所述的二萜和倍半萜类具有进一步开发神经保护药物的前景。
[0079]
一种药物组合物，以所述的玉米须中具有神经细胞保护的萜类化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，与药学上可接受的赋形剂混合制备成的组合物，并制备成临床上可接受的剂型，所述赋形剂是指能够用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体，所述剂型为注射剂、片剂或胶囊剂。
[0080]
本发明所述的玉米须中具有神经细胞保护的萜类化合物或其药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备治疗神经保护药物中应用。
[0081]
本发明的优点在于，所述化合物均为立体构型确定的光学纯化合物，同时具有很强的神经细胞保护，具有进一步开发的价值。
附图说明
[0082]
图1化合物1的uv谱；
[0083]
图2化合物1的(+)-hresims；
[0084]
图3计算简化后结构1a和1b；
[0085]
图4化合物2的单晶图；
[0086]
图5化合物2的uv谱；
[0087]
图6化合物2的(+)-hresims；
[0088]
图7计算简化后结构2a和2b；
[0089]
图8化合物3的uv谱；
[0090]
图9化合物3的(+)-hresims；
[0091]
图10化合物4的uv谱；
[0092]
图11化合物4的(+)-hresims；
[0093]
图12化合物5的uv谱；
[0094]
图13化合物5的(+)-hresims；
[0095]
图14化合物6的uv谱；
[0096]
图15化合物6的(+)-hresims；
[0097]
图16化合物7的uv谱；
[0098]
图17化合物7的(+)-hresims；
[0099]
图18化合物8的uv谱；
[0100]
图19化合物8的(+)-hresims；
[0101]
图20化合物9的uv谱；
[0102]
图21化合物9的(+)-hresims；
[0103]
图22化合物10的uv谱；
[0104]
图23化合物10的(+)-hresims；
[0105]
图24化合物11的uv谱；
[0106]
图25化合物11的(+)-hresims；
[0107]
图26化合物11的计算核磁分析；
[0108]
图27化合物1-11的关键hmbc相关及cosy相关；
[0109]
图28化合物1-8的关键noesy相关；
[0110]
图29化合物9-11的实测ecd与计算ecd的比较图；
[0111]
图30化合物1-12的神经细胞保护活性；
[0112]
图31化合物4减轻h2o2诱导的sh-sy5y细胞凋亡图。相差显微镜下细胞形态变化；hoechst 33324染色观察核形态变化；ao/eb染色观察凋亡细胞；jc-1观察线粒体膜电位变化；
[0113]
图32化合物5减轻h2o2诱导的sh-sy5y细胞凋亡图。相差显微镜下细胞形态变化；hoechst 33324染色观察核形态变化；ao/eb染色观察凋亡细胞；jc-1观察线粒体膜电位变化。
具体实施方式
[0114]
下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0115]
实施例1
[0116]
所述的玉米须中具有神经细胞保护的萜类化合物1-11的制备：
[0117]
(1)取玉米须(zea mays)的干燥花柱和柱头100kg，用70％工业乙醇加热回流提取3次，每次2h。
[0118]
(2)得到的乙醇提取液在55-65℃经减压浓缩合并，得到总浸膏2kg。将其用乙酸乙酯和正丁醇溶剂萃取，得到乙酸乙酯层350g和正丁醇层864g。
[0119]
(3)乙酸乙酯层和正丁醇层交叉合并后的样品经过硅胶减压柱色谱ch2cl
2-meoh＝50:1-1:1梯度洗脱，得到6个流分fr.a～fr.f。
[0120]
(4)流分fr.b(150g)经过hp-20和ods柱色谱etoh:h2o＝20:80-100:0梯度洗脱，分离得到4个流分fr.b1～fr.b4。
[0121]
(5)将fr.b1通过半制备hplc分离得到化合物1(34.6mg),2(8.7mg),3(3.5mg),4(3.0mg),5(2.0mg),6(2.0mg),7(6.7mg),8(20.1mg)，半制备hplc的梯度洗脱条件为ch3cn:h2o＝40:60-60:40。
[0122]
(6)将fr.b2通过半制备hplc分离得到化合物9(14.4mg),10(12.0mg),11(2.1mg)，半制备hplc的梯度洗脱条件为ch3cn:h2o＝30:70。
[0123]
实施例2
[0124]
所述化合物1-11对神经细胞sh-sy5y氧化损伤的保护作用考察：
[0125]
实验分别设置模型组、给药组、阴性及空白对照组4个组，每组均设置3个复孔。
[0126]
h2o2模型组：sh-sy5y细胞依次经传代、常规培养、无血清培养液稀释之后，在96孔培养板中接种。于恒温培养箱(37℃，5％ co2)中静置培养12h至细胞贴壁后使用含血清培养液接着培养2h,再向每孔加h2o2使终浓度为200μmol/l，作用5h后mtt测细胞活力。
[0127]
给药组：细胞培养过程同上，然后加入含待测化合物(25,50,100μmol/l)的培养液在相同条件孵育2h，再向每个孔加h2o2(200μmol/l)反应5h。
[0128]
阴性对照组：细胞培养过程同上，不加受试化合物及h2o2，其它步骤同上。
[0129]
空白对照组：不加受试化合物及h2o2、不接种细胞，其它步骤同上。
[0130]
最后用酶标仪(λ＝490nm)测每孔的吸光度值(a)。
[0131]
如图30所示，化合物4和5在三个浓度下(12.5μm,25μm,50μm)均表现出强于阳性药活性。
[0132]
以300μm的h2o2培养sh-sy5y细胞4h。在加入或不加入化合物4和5的条件下，使用相差显微镜观察细胞形态，运用ao-eb,hoechst 33258和jc-1对发生凋亡的细胞核进行形态学观察。sh-sy5y细胞在应用或者不应用不同浓度的(25,50,100μm)化合物4和5的条件下，接种于6孔培养板中，接种密度为(4
×
105个/孔)并培养3h。培养3h后，弃去上层培养液，用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗两次，随后用ao-eb,hoechst 33258和jc-1进行染色。培养板于室温下在暗处静置15min。染色完成后，将培养板置于荧光显微镜下观察细胞核形态，并进行拍照。如图31-32所示，化合物4和5的ao-eb,hoechst 33258和jc-1染色结果显示化合物4和5能够减轻h2o2诱导的sh-sy5y细胞凋亡和线粒体功能障碍。