猫杯状病毒培养方法及病毒液与流程

1.本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猫杯状病毒培养方法及病毒液。


背景技术：

2.猫杯状病毒（feline calicivirus, fcv）是一种导致猫传染性鼻结膜炎的病毒，会导致猫的轻度至重度呼吸道感染和口腔疾病。猫感染fcv后，会出现精神沉郁，打喷嚏，口、鼻、眼分泌物增多和角膜炎等症状。fcv具有高度传染性，发生率较高。由fcv引起的幼猫死亡率高达30%。目前认为，fcv呈世界性分布，并可能感染所有猫科动物，我国猫群中亦存在fcv抗体。
3.针对fcv病毒，免疫疫苗是最好的选择。国外预防fcv主要使用灭活疫苗和弱毒疫苗。在疫苗制备过程中，抗原培养是最重要的一环。找到一种安全、有效、产量高的培养fcv的方法，对fcv疫苗的研发和制备具有关键作用。如何实现猫杯状病毒的大规模扩增，有效降低生产成本，进一步提高产品质量是目前本领域的研究难点。


技术实现要素：

4.有鉴于背景技术中存在的问题，本发明首先提供了一种猫杯状病毒培养方法，使用微载体培养宿主细胞，接毒，继续培养，得到病毒液。
5.在本发明中，所述宿主细胞包括f81细胞和/或crfk细胞，优选包括f81细胞。
6.本发明中，使用微载体培养宿主细胞的方法包括：在宿主细胞悬液中加入微载体；所述宿主细胞悬液的细胞密度为1.8
×
106cells/ml-2.2
×
106cells/ml；优选为2
×
106cells/ml；所述微载体在所述宿主细胞悬液中的加入量为2.5-3.5g/l，优选为3g/l；所述微载体以交联葡聚糖为基质，密度为1.01-1.05g/ml；颗粒大小为185-195μm；表面积≥4200cm2；优选地，所述微载体型号选择cytodex-1型，cytodex-1型微载体是以交联葡聚糖为基质，表面带正电荷；微载体密度为1.03g/ml；颗粒大小190μm；表面积4400cm2。
7.本发明研究了不同规格微载体的培养效果，发现以交联葡聚糖为基质，密度为1.01-1.05g/ml；颗粒大小为185-195μm；表面积≥4200cm2的微载体更适于猫杯状病毒的培养。在本发明所述宿主细胞密度和微载体添加浓度条件下，利用所述微载体培养宿主细胞的效果良好，得到的猫杯状病毒滴度更高，可达到10.5 logtcid
50
/ml。其他规格的微载体和猫杯状病毒培养的适配度相对较差，宿主细胞脱落现象严重，且宿主细胞培养活性不高，培养后细胞密度低，得到的猫杯状病毒滴度显著降低。
8.在本发明更具体的优选实施方式中，所述微载体型号选择cytodex-1型。和其他型号的微载体相比，cytodex-1型微载体的相对表面积更大，每毫升培养液可得到数百万细胞。较贴壁培养可以更快速的放大产量。且微载体培养细胞在培养液上可以延续贴壁培养阶段的基础培养基，相较于全悬浮培养，省去了筛选优化培养基的工序，使成本更少，且有助于加快研发速度。
9.在本发明中，所述接毒的时间优选为使用微载体培养宿主细胞的42-54h，更优选为使用微载体培养宿主细胞的47-49h，更优选为使用微载体培养宿主细胞的48h。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法，在微载体培养宿主细胞48h时进行接毒，收获的病毒液毒价高达10.5 logtcid
50
/ml。
10.在本发明中，所述接毒时，宿主细胞的密度优选为2.8
×
106cells/ml-3.2
×
106cells/ml，更优选为3
×
106cells/ml。
11.在本发明中，所述接毒的moi值优选为0.08-0.15，更优选为0.1。按本发明所述moi值接入细胞，能实现较快的病毒侵染速率，同时有助于获得较高的毒价。
12.在本发明中，所述接毒后，继续培养的时间优选为30-36h，更优选为30h。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法，在接毒后30h即可收获病毒液，病毒液培养时间较短，且收获的病毒液毒价高达11.0 logtcid
50
/ml。
13.在本发明中，继续培养后的宿主细胞脱落比例优选为45%-55%，更优选为50%。
14.在本发明中，继续培养后的宿主细胞活力优选≤50%。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法，在宿主细胞活力≤50%时收获病毒液，毒价可高达11.5 logtcid
50
/ml。
15.本发明优选使用生物反应器进行培养。在本发明中，所述生物反应器的溶氧量优选为35%-45%，更优选为40%；转速优选为20-80rpm，更优选为50rpm；温度优选为30-41℃，更优选为36-39℃，更优选为37℃。
16.在本发明中，所述微载体可以是首次使用的微载体，也可以是重复使用1-2次的微载体。经验证，本发明提供的猫杯状病毒培养方法能重复使用微载体，且重复使用1-2次的微载体空球率低于10%。重复使用微载体能有效降低猫杯状病毒的培养成本。
17.本发明还提供了一种病毒液，由所述猫杯状病毒培养方法制备得到。
有益效果
18.本发明提供了一种猫杯状病毒培养方法，利用微载体培养猫杯状病毒，能显著提高猫杯状病毒滴度。经实验验证，本发明所述方法制备得到的猫杯状病毒滴度≥10
10.5
tcid
50
。
19.本发明提供的猫杯状病毒培养方法具有生产工艺稳定，重复性好的优点，能有效降低生产成本，显著提高产品质量。
具体实施方式
20.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。本发明中，所用原料、仪器等均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中所用的原料均可在国内产品市场方便买到。
21.实施例1 f81细胞培养1、材料
①
f81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：f81
‑ꢀ
ac21001d-f16）。
22.②
胰蛋白酶。
23.③
dmem培养基，购自gibco公司。
24.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
25.⑤
细胞培养瓶(型号为t25、t75、t225)，购自赛默飞世尔科技公司。
26.⑥
cytodex-1型微载体，购自ge公司。
27.⑦
细胞摇瓶(型号为250ml)，购自赛默飞世尔科技公司。
28.2、种细胞传代将一支f81细胞从液氮中取出，加入含10%新生牛血清的dmem培养液，置于t25培养瓶中培养；培养72h，待细胞铺满细胞培养瓶底面时，使用胰蛋白酶进行消化，按1:3比例传代，置于t75培养瓶中培养；依照上述步骤逐级扩大，直至f81细胞在t225培养瓶中稳定培养。
29.3、微载体培养f81细胞选取在t225细胞培养瓶中长满单层的细胞2瓶，使用胰蛋白酶进行消化，将2瓶消化后的细胞悬液混合，使用细胞营养液（dmem+10%nbs）定容至100ml后进行细胞计数（密度2
×
106cells/ml；且活力》95%），之后将100ml细胞悬液置于250ml摇瓶中。摇瓶中加入0.3g预培养的cytodex-1微载体，置于37℃，5%二氧化碳摇床中培养。每隔24h取样计数，并将样品在倒置显微镜下观察。
30.4、结果参见表1。如表1所示：细胞在cytodex-1微载体中培养的生长速度良好。
31.表1：cytodex-1型微载体对f81细胞的培养情况
32.实施例2 接毒培养1、材料
①
f81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：f81
‑ꢀ
ac21001d-f16）。
33.②
胰蛋白酶。
34.③
dmem培养基，购自gibco公司。
35.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
36.⑤
cytodex-1型微载体。
37.⑥
fcv种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：fcv-v22012-f12），毒价10
9.5
tcid
50
/ml。
38.⑦
细胞摇瓶(型号为250ml)。
39.2、接毒
①
配制f81细胞悬液200ml，密度：2
×
106cells/ml；活力》95%。
40.②
f81细胞悬液混匀后置于2个250ml摇瓶（编号1#，2#）中，每个摇瓶100ml。
41.③
cytodex-1型微载体分别加入2个摇瓶中，每个摇瓶添加量为0.3g。
42.④
组别设置：1#摇瓶在加入微载体后48h接毒（接毒0.1ml）;2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。
43.3、收获接毒后每隔12h取样观察细胞状态，待细胞从微球上脱落50%时收获。
44.4、结果参见表2。如表2所示：在微载体培养f81细胞48h后接毒，收获时间短且接毒毒价达到10.5 logtcid
50
/ml。
45.表2：加入微载体后培养48h后接毒的收获情况
46.实施例3 接毒培养1、材料
①
f81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：f81
‑ꢀ
ac21001d-f16）。
47.②
胰蛋白酶。
48.③
dmem培养基，购自gibco公司。
49.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
50.⑤
cytodex-1型微载体。
51.⑥
fcv种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：fcv-v22012-f12），毒价10
9.5
tcid
50
/ml。
52.⑦
细胞摇瓶(型号为250ml)。
53.2、接毒
①
配制f81细胞悬液200ml，密度：2
×
106cells/ml；活力》95%。
54.②
f81细胞悬液混匀后置于2个250ml摇瓶（编号1#，2#）中，每个摇瓶100ml。
55.③
cytodex-1型微载体分别加入2个摇瓶中，每个摇瓶添加量为0.3g。
56.④
组别设置：1#摇瓶在加入微载体48h接毒（接毒moi值0.1）;2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。
57.3、收获接毒后每隔12h取样观察细胞状态，待细胞从微球上脱落50%时收获。
58.4、结果参见表3。如表3所示：接毒moi值为0.1时，接毒毒价可达到11.0 logtcid
50
/ml。
59.表3：接毒moi值为0.1时，接毒的收获情况
60.实施例4 接毒培养1、材料
①
f81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：f81
‑ꢀ
ac21001d-f16）。
61.②
胰蛋白酶。
62.③
dmem培养基，购自gibco公司。
63.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
64.⑤
cytodex-1型微载体。
65.⑥
fcv种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：fcv-v22012-f12），毒价10
9.5
tcid
50
/ml。
66.⑦
细胞摇瓶(型号为250ml)。
67.2、接毒
①
配制f81细胞悬液200ml，密度：2
×
106cells/ml；活力》95%。编号为1#、2#。
68.②
f81细胞悬液混匀后置于2个250ml摇瓶中，每个摇瓶100ml。
69.③
cytodex-1型微载体分别加入2个摇瓶中，每个摇瓶0.3g。
70.④
组别设置：1#摇瓶在加入微载体48h接毒（接毒moi值0.1）。
71.2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。
72.3、收获接毒后每隔6h从1#摇瓶中取样，样品计数、显微镜下观察、留样放置于-70℃冻存待取样结束后测毒。
73.4、结果不同收获时间对培养情况的影响结果参见表4。如表4所示：接毒后30h，细胞从微球上脱落50%时，毒价最高。
74.表4：接毒培养后，不同收获时间的培养情况
75.实施例5 微载体培养fcv反应器扩大培养1、材料
①
f81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：f81
‑ꢀ
ac21001d-f16）。
76.②
胰蛋白酶。
77.③
dmem培养基，购自gibco公司。
78.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
79.⑤
cytodex-1型微载体。
80.⑥
fcv种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：fcv-v22012-f12），毒价10
9.5
tcid
50
/ml。
81.⑦
3l生物反应器。
82.2、接毒
①
配制f81细胞悬液1l，密度：2
×
106cells/ml；活力》95%。
83.②
f81细胞悬液混匀后置于生物反应器中。
84.③
生物反应器加入cytodex-1型微载体3g。
85.④
生物反应器培养微载体f81细胞48h后（密度达到3
×
106cells/ml）接毒（接毒moi值0.1）。
86.3、生物反应器参数设置
①
溶氧：40%。
87.②
转速：50rpm。
88.③
温度：37℃。
89.4、结果接毒后30h，细胞从微球上脱落50%时收获。重复三批试验，结果参见表5。由表5可
知：接毒后30h，细胞从微载体上脱落比例为50%时收获，毒价高于11.0 logtcid
50
/ml。细胞活力为50%以下时收获，毒价可达到11.5 logtcid
50
/ml。
90.表5：反应器培养结果
91.实施例6 微载体回收与重复使用验证将实施例5中使用反应器验证fcv培养条件的微载体用强酸溶液洗涤，洗涤后的微载体重复培养f81细胞，与新微载体培养f81细胞进行对比，比较回收效果。
92.结果参见表6。如表6所示：微载体重复使用两次与新微载体无明显差别。
93.表6：微载体回收使用情况
94.对比例1本对比例提供了另一种f81细胞培养方法；与实施例1相比，区别点仅在于：培养用微载体使用cytodex-3型（以交联葡聚糖为基质，表面带正电荷；微载体密度为1.04g/ml；颗粒大小175μm；表面积2700cm2），购自gibco公司。
95.对比例1使用cytodex-3型微载体对f81细胞的培养情况参见表7。
96.表7：cytodex-3型微载体对f81细胞的培养情况
97.对比例2本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶在加入微载体后直接接毒。
98.对比例3本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶在加入微载体后12h接毒。
99.对比例4本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶在加入微载体后24h接毒。
100.对比例2-4的接毒收获情况参见表8。
101.表8：对比例2-4的接毒后收获情况
102.对比例5本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶同样是在加入微载体48h接毒，但接毒的moi值为0.05。
103.对比例6本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶同样是在加入微载体48h接毒，但接毒的moi值为0.3。
104.对比例7本对比例提供了另一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：摇瓶同样是在加入微载体48h接毒，但接毒的moi值为0.5。
105.对比例5-7的接毒收获情况参见表9。
106.表9：对比例5-7的接毒后收获情况
107.对比例8本对比例提供了一种贴壁培养fcv方法，具体如下：1、材料
①
f81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：f81
‑ꢀ
ac21001d-f16）。
108.②
胰蛋白酶。
109.③
dmem培养基，购自gibco公司。
110.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
111.⑤
fcv种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：fcv-v22012-f12），毒价10
9.5
tcid
50
/ml。
112.⑥
细胞培养瓶(型号为t225)，购自赛默飞世尔科技公司。
113.2、接毒使用t225细胞培养瓶培养fcv：配制f81细胞悬液100ml，密度：2
×
106cells/ml；活力》95%。f81细胞悬液混匀后置于t225细胞培养瓶中。t225细胞培养瓶培养f81细胞48h后接毒（接毒moi值0.1）。培养收获后，测定tcid
50
。
114.3、结果同实施例5微载体培养情况进行比对，结果参见表10。如表10所示：本发明实施例5利用微载体培养fcv抗原，其毒价较对比例8的贴壁培养高出2个滴度。
115.表10：微载体培养与贴壁培养毒价对比情况
116.对比例9本对比例提供了一种使用cytodex-1型微载体培养crfk细胞的方法；与实施例1相比，区别点仅在于：使用crfk细胞作为宿主细胞。
117.1、材料
①
crfk细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：crfk
‑ꢀ
ac21003d-f23）。
118.②
胰蛋白酶。
119.③
dmem培养基，购自gibco公司。
120.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
121.⑤
细胞培养瓶(型号为t25、t75、t225)，购自赛默飞世尔科技公司。
122.⑥
cytodex-1型微载体，购自ge公司。
123.⑦
细胞摇瓶(型号为250ml)，购自赛默飞世尔科技公司。
124.2、种细胞传代将一支crfk细胞从液氮中取出，加入含10%新生牛血清的dmem培养液，置于t25培养瓶中培养；培养72h，待细胞铺满细胞培养瓶底面时，使用胰蛋白酶进行消化，按1:3比例传代，置于t75培养瓶中培养；依照上述步骤逐级扩大，直至f81细胞在t225培养瓶中稳定培养。
125.3、微载体培养crfk细胞选取在t225细胞培养瓶中长满单层的细胞2瓶，使用胰蛋白酶进行消化，将2瓶消化后的细胞悬液混合，使用细胞营养液（dmem+10%nbs）定容至100ml后进行细胞计数（密度2
×
106cells/ml；且活力》95%），之后将100ml细胞悬液置于250ml摇瓶中。摇瓶中加入0.3g预培养的cytodex-1微载体，置于37℃，5%二氧化碳摇床中培养。每隔24h取样计数，并将样品在倒置显微镜下观察。
126.4、结果参见表11。如表11所示：crfk细胞在cytodex-1微载体中培养的细胞脱落比例较高，且生长速度显著低于实施例1中f81细胞的生长速度。crfk细胞培养48h后的细胞密度仅为3.3
×
106cells/ml，不适于后续的接毒培养。
127.表11：cytodex-1型微载体对crfk细胞的培养情况
128.对比例10本对比例提供了一种接毒培养方法；与实施例2相比，区别点仅在于：使用crfk细胞作为宿主细胞。
129.1、材料
①
crfk细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：crfk
‑ꢀ
ac21003d-f23）。
130.②
胰蛋白酶。
131.③
dmem培养基，购自gibco公司。
132.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
133.⑤
cytodex-1型微载体。
134.⑥
fcv种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：fcv-v22012-f12），毒价10
9.5
tcid
50
/ml。
135.⑦
细胞摇瓶(型号为250ml)。
136.2、接毒
①
配制crfk细胞悬液200ml，密度：2
×
106cells/ml；活力》95%。
137.②
crfk细胞悬液混匀后置于2个250ml摇瓶（编号1#，2#）中，每个摇瓶100ml。
138.③
cytodex-1型微载体分别加入2个摇瓶中，每个摇瓶添加量为0.3g。
139.④
组别设置：1#摇瓶在加入微载体后48h接毒（接毒0.1ml）;2#摇瓶作为细胞对照，不接毒。
140.3、收获接毒后每隔12h取样观察细胞状态并将样品测tcid
50
，待细胞从微球上脱落50%时收获。
141.4、结果参见表12。如表12所示：在微载体培养crfk细胞48h后接毒，接毒的毒价无提升。
142.表12：加入微载体后培养48h后接毒的收获情况
143.对比例11本对比例提供了一种使用微载体培养fcv反应器扩大培养的方法；与实施例5相比，区别点仅在于在反应器扩大培养fcv接毒前通过沉降更换细胞培养液（dmem+新生牛血清），使用细胞维持液（无血清dmem）培养fcv。
144.1、材料
①
f81细胞（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存；冻存批号：f81
‑ꢀ
ac21001d-f16）。
145.②
胰蛋白酶。
146.③
dmem培养基，购自gibco公司。
147.④
新生牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司。
148.⑤
cytodex-1型微载体。
149.⑥
fcv种毒（辽宁益康生物股份有限公司赠送，金宇保灵生物药品有限公司保存。批号：fcv-v22012-f12），毒价10
9.5
tcid
50
/ml。
150.⑦
3l生物反应器。
151.2、接毒
①
配制f81细胞悬液1l，密度：2
×
106cells/ml；活力》95%。
152.②
f81细胞悬液混匀后置于生物反应器中。
153.③
生物反应器加入cytodex-1型微载体3g。
154.④
生物反应器培养微载体f81细胞48h后（密度达到3
×
106cells/ml）后，停止反应器搅拌，并将反应器温度调整为8℃，待，微载体全部沉降完成后，将细胞营养液（dmem+新生
牛血清）置换为细胞维持液（无血清dmem）。置换完成后，将生物反应器参数调整为溶氧：40%，转速：50rpm，温度：37℃。待细胞稳定重悬后接毒（接毒moi值0.1）。
155.3、生物反应器参数设置
①
溶氧：40%。
156.②
转速：50rpm。
157.③
温度：37℃。
158.4、结果接毒后，待细胞从微球上脱落50%时收获（约30h）。重复三批试验，结果参见表13。由表13可知：接毒后，待细胞从微载体上脱落比例为50%时收获，毒价大于等于9.5 logtcid
50
/ml，其中，当在细胞活力为50%以下收获时，毒价可达到10.0 logtcid
50
/ml。
159.同实施例5比对可以看出：换液培养fcv毒价低于不换液培养毒价。另外，换液培养还延长了培养时间，且在培养过程中换液易造成细胞的污染。
160.表13：反应器培养结果
161.综上，本发明通过微载体悬浮方式培养fcv抗原。微载体培养在提升抗原培养量的情况下提高了毒价。另外，本发明提供的利用微载体培养猫杯状病毒的方法，显著降低了培养成本。和贴壁培养方式比：本发明利用微载体培养，更容易放大。例如，培养3l抗原，用贴壁方式需要耗费近30个t225细胞培养瓶，而微载体只需要培养一次，耗费9g微载体即可实现（且微载体可以重复利用，t225细胞培养瓶不可重复利用）。和悬浮培养方式比：本发明利用微载体培养，只需要用最基础的培养基，而悬浮培养需要使用特定的培养基。悬浮培养中，筛选培养基是非常庞大的工程。本发明使用微载体培养，极大地减少了因筛选培养基导致的过高成本。
162.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。