一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法与流程

1.本发明涉及生物化学制品制备和检测技术领域，具体为一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法。


背景技术：

2.无机焦磷酸酶(inorganic pyroposphatease，ppase)是一类能够催化焦磷酸水解为正磷酸的酶。焦磷酸(pyrophosphoric acid，ppi)是生物体内dna和rna聚合、氨基酸活化、氨酰trna合成、脂肪酸的β-氧化、脂酰辅酶a合成、纤维素合成、葡萄糖合成以及淀粉合成等过程的副产物，ppase通过分解ppi可使上述反应向合成方向进行，并为多种生物合成反应提供能量。
3.ppase广泛存在于自然界，在动物、植物和微生物中均有发现，并随着技术手段的发展，现已成功地从日本吸血虫、水稻、大麦、烟草、酵母、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌以及嗜热细菌中获得了ppase的cdna克隆。
4.ppase在体外具有增强dna聚合酶的扩增效率以及增强rna聚合酶在体外转录反应中的产量的功能。应用于核酸扩增实验中，避免其对反应体系的抑制。在分子生物学中可用于反转录反应中以提升体外转录rna的产量。自然条件下，无机焦磷酸酶可以为蛋白、rna和dna的生物合成反应提供热力学动力，并在脂代谢，钙吸收以及骨形成等生物转化过程中发挥作用。在实验应用中能够高效发挥作用，保证反应的进行。
5.焦磷酸酶(pyrophosphatase，ppase)是作用于双磷酸键上的酸酐水解酶，催化水解一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子，无机焦磷酸酶与镁离子结合后可催化水解无机焦磷酸生成正磷酸盐：p2o
7-4
+h2o+ppase
→
2hpo
4-2
，这是一个高放能的反应，因此此反应可偶联到一些热力学上不利的转化，以便驱动这些转化进行到完全，酶水解过程可以释放能量驱动一些反应完成。
6.焦磷酸酶活性的准确测定在生物学中的应用扮演着十分重要的作用，例如产酶菌株的筛选、改造以及疾病的诊断方面。目前酶活检测普遍采用的方法有：酶催化法、荧光法以及比色法等。
7.酶催化法是用荧光素酶的自身荧光来达到酶活的检测，例如jonas eriksson等人利用焦磷酸钠能抑制荧光素酶活性，而它又能被焦磷酸酶水解，从而恢复荧光素酶的荧光，最终达到焦磷酸酶活的检测的目的。
8.荧光法是在目标底物上键合荧光基团，当焦磷酸酶催化水解底物时，其荧光信号会随酶催化反应而发生改变。目前mao等用了一种新的比色法检测焦磷酸酶利用铜离子与焦磷酸钠的结合能力强于与半胱氨酸的结合能力来调节纳米金聚集/分散，然后焦磷酸酶催化水解焦磷酸，纳米金恢复聚集，通过纳米金颜色的改变，实现实时检测焦磷酸酶的活性。
9.现有的方法还有酶联免疫吸附测定(elisa)、滴定法。这些方法虽各有长处，但还有各种局限性没有成为主流的方法，例如：灵敏度不高，误差大；特异性不强；费时费力，不
适合酶的高通量检测。
10.如专利cn104237193a公开了一种检测焦磷酸酶的荧光传感器及其制备方法，该方法在检测焦磷酸酶活性时，需要制备叠氮香豆素，制备过程需要加入高能叠氮化物，具有一定的危险性。专利cn108051418a公开了一种新型无机焦磷酸酶活性检测方法，该方法在制备二维金属有机骨架材料cu-bdc-mof纳米片时，过程耗时(不包括其它步骤，仅反应就需要24-48小时)且需要n，n-二甲基甲酰胺和乙腈等有机溶剂，对环境会造成一定的危害。


技术实现要素：

11.(一)解决的技术问题
12.针对现有技术的不足，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法。具有诱导表达简单，分离纯化步骤少，生产周期短、操作简单、分析速度快、成本低，灵敏度高、多次测定误差较低等特点，本发明的目的在于针对现有技术的不足，解决现有技术测定方法不便于操作，周期长及精度低等缺陷的问题。
13.(二)技术方案
14.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，包括以下步骤：
15.s1：准备仪器、试剂、溶液配制；
16.s2：质粒转化；
17.s3：诱导表达；
18.s4：菌体破碎；
19.s5：ni亲和层析；
20.s6：deae阴离子交换层析；
21.s7：g25凝胶过滤层析；
22.s8：活性测定。
23.优选的，所述s1中，仪器包括：生物安全柜、恒温培养箱、电子天平。
24.优选的，所述s1中，试剂包括：nacl、tryptone、yeast extract、agar、rosetta、m15(prep4)、novablue(de3)、er2566、rosetta-gami(de3)、rosetta(de3)。
25.优选的，所述溶液配制包括：tryptone、yeast extract、nacl、water。
26.优选的，所述s2-s8中，通过无机焦磷酸酶在1
×
反应缓冲液(含有tris-hcl、mgcl2)中水解焦磷酸盐为磷酸盐，反应条件为25℃，30min，反应结束后65℃，10min对酶进行灭活后，使用磷酸盐比色分析试剂盒对反应体系中的磷酸盐进行检测，反应产生的磷酸盐会与试剂盒中显色络合物进行反应，产生在650nm处有吸光度值的络合物，通过紫外分光光度计测定吸光度值。
27.优选的，所述s2-s8中，1单位指在标准反应条件下，每分钟催化无机焦磷酸ppi，生成1μmol磷酸盐pi所需的酶量。
28.优选的，所述s2-s8中，500μl体系中包含100mm tris-hcl ph7.2，2mm mgcl2，2mm ppi；25℃反应30min。
29.(三)有益效果
30.与现有技术相比，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，
具备以下有益效果：
31.1、该一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，通过本发明的方法获得的无机焦磷酸酶诱导表达条件简单，分离纯化步骤少，生产周期短，获得目的蛋白纯度和浓度更高。
32.2、该一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，无需使用放射性同位素或者昂贵的毛细管电泳仪器，检测成本低，结果直观准确、简单高效、操作简单，多次测定误差较低。
33.3、该一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，建立了一种无机焦磷酸酶活性检测方法使用化学试剂都为常规化学品，不使用放射性物质，具有较强推广使用价值。
34.4、该一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，本实验耗时短，30min内即可测定无机焦磷酸酶的活性；
35.5、该一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，本实验操作简单可以在普通实验室进行，对操作人员及场所没有特殊要求；
36.6、该一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，本实验使用试剂成分简单，减少了其他酶或者试剂的干扰；
37.7、该一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法，通过公开的无机焦磷酸酶(e.coli)纯化自携带e.coli无机焦磷酸酶基因的重组e.coli菌株，ppase(pyrophosphatase，inorganic，无机焦磷酸酶)的分子量约为19.2kd，gmp grade(0.1u/μl)，-30-15℃保存，干冰运输条件：≤0℃，最佳反应温度25℃，产品特性和应用具备：(1)优化rna转录：提高体外转录反应的rna产量；(2)优化pcr反应：提高效率，增加dna产量；(3)去除利用焦磷酸盐测定法来进行snp基因分型试剂中的ppi污染物；(4)催化ppi+h2o
→
2pi的反应；(5)促进蛋白质、rna和dna的合成。
附图说明
38.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
39.图1为本发明筛选的不同感受态细胞的单克隆平板图；
40.图2为本发明不同感受态细胞诱导表达的sds-page图；
41.图3为本发明ni柱亲和层析的色谱图；
42.图4为本发明ni柱亲和层析的电泳图；
43.图5为本发明deae阴离子交换层的色谱图；
44.图6为本发明deae阴离子交换层的电泳图；
45.图7为本发明g25凝胶过滤层析色谱图；
46.图8为本发明g25凝胶过滤层析电泳图；
47.图9为本发明孵育前后焦磷酸盐拍照图；
48.图10为本发明磷酸盐标准品标准曲线图；
49.图11为本发明待测焦磷酸酶稀释5倍检测不同量焦磷酸盐a650标准曲线图；
50.图12为本发明neb焦磷酸酶稀释5倍检测不同量焦磷酸盐a650标准曲线图。
51.图1中，上左为rosetta感受态细胞，上右为1011感受态细胞，中左为1010感受态细
胞，中右为1060感受态细胞，下左为1080感受态细胞，下右为1090感受态细胞。
具体实施方式
52.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
53.实施例1
54.如图1-12所示，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法,检测无机焦磷酸酶质粒转化，包括以下步骤：
55.s1：选取设备包括：生物安全柜、恒温培养箱、电子天平，试剂选取包括：nacl、tryptone、yeast extract、agar、rosetta、m15(prep4)、er2566、rosetta-gami(de3)、rosetta(de3)；溶液配制包括：tryptone、yeast extract、nacl、water；
56.s2：lb液体培养基：精确称量tryptone、yeast extract和nacl，加入约800ml去离子水搅拌溶解均匀，量筒定容至1l，121℃，灭菌30min自然冷却至室温；
57.s3：lb固体培养基：精确称量tryptone、yeast extract和nacl，加入约100ml去离子水搅拌溶解均匀，量筒定容至1l，加入1.5％agar powder，121℃，灭菌20min。冷却至约50℃，加入终浓度0.1mg/ml的kan
+
，混合均匀后制作平板，冷却凝固后4℃储存；
58.s4：实验：
59.取1支康为世纪rosetta(de3)、上海唯地(1090、1080、1060、1011、1010)感受态细胞冰上放置20/5min，待感受态细胞解冻为液体状态；取1μl10ng/μl的无机焦磷酸酶质粒加入到解冻的感受态细胞中(50μl-100μl)，轻轻弹两下混匀，冰上静止25min；42℃水浴热激90s后迅速冰浴5min；加入1000μl新鲜无抗lb液体培养基，置于摇床200rpm 37℃培养1h；取200μl均匀涂布于kan
+
抗性(0.1％和0.2％)的lb平板中，37℃恒温培养箱培养16h。
60.通过实施例一，且结合附图1，从筛选的不同感受态细胞的单克隆平板图可以看出：rosetta、1011、1010、1060、1080、1090感受态细胞都能使无机焦磷酸酶的质粒转化，感受态优选1010(rosetta de3)、1060(er2566)、cw0811s(康为世纪rosetta de3)。
61.实施例2
62.如图1-12所示，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法,检测无机焦磷酸酶诱导表达，包括以下步骤：
63.s1：选取主要仪器包括：生物安全柜、恒温培养箱、恒温震荡器、电子天平、可见分光光度计、落地离心机；选取主要试剂包括：nacl、tryptone、yeast extract、agar、iptg、kan+；溶液配制包括：tryptone、yeast extract、nacl、water；
64.s2：lb液体培养基：按照上表精确称量tryptone、yeast extract和nacl，加入约800ml去离子水搅拌溶解均匀，量筒定容至1l，121℃，灭菌30min自然冷却至室温；
65.s3：实验：
66.挑取平板中长势正常的抗性高的单克隆菌落到150ml kan
+
抗性的lb液体培养基中，置于摇床200rpm 37℃培养16h；取10ml上述步骤培养好的菌种接种于1l的kan+抗性的lb液体培养基中，150rpm 37℃培养3h；待培养的菌液浓度od
600
在0.6左右时加入iptg终浓度为0.5mm和1.0mm，等加完iptg后，温度降到16℃，开始计时诱导表达16h。
67.od
600
数值记录表
68.idrosetta-1.0mm1080-1.0mm1060-1.0mm1010-1.0mm1070-1.0mmod
600
0.650.520.740.680.61idrosetta-0.5mm1080-0.5mm1060-0.5mm1010-0.5mm1070-0.5mmod
600
0.650.540.730.730.60
69.使用落地离心机收菌，设置6500rpm，4℃，15min，去尽残留培养基收集沉淀，称量所得菌体湿重如下表。
70.idrosetta-1.0mm1080-1.0mm1060-1.0mm1010-1.0mm1070-1.0mm湿重/g4.173.443.085.803.00单位湿重g/l4.173.443.085.803.00idrosetta-0.5mm1080-0.5mm1060-0.5mm1010-0.5mm1070-0.5mm湿重/g4.213.533.085.702.98单位湿重g/l4.173.443.085.802.98
71.通过实施例二，且结合附图2，iptg优选0.5mm进行放大诱导培养；感受态优选1010(rosetta de3)、1060(er2566)、cw0811s(康为世纪rosettade3)。
72.实施例3
73.如图1-12所示，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法,检测菌体破碎，包括以下步骤：
74.s1选取主要试剂：ni-lysis buffer(50mm tris-hcl，100mm kcl，1mm edta，1mm dtt，1mm pmsf，0.5％tween 20，0.5％ca630，5％glycerol，ph＝7.9)，主要仪器包括：高压破碎、雪花制冰机、落地离心机、涡旋振荡仪，选取样品无机焦磷酸酶湿菌体10g。
75.s2：使用电子天平称量湿菌10g，放入50ml离心管中；
76.s3：实验：
77.用量桶量取35ml ni-lysis buffer加入烧杯中，使用涡旋混匀仪快速涡旋均匀直至肉眼观察无明显菌块，磁力搅拌器搅拌至无块状菌体，此步可分多次进行；最后使用ni-lysis buffer定容至50ml，置于冰浴中备用；依次开启高压均质机制冷电源、制冷、循环按钮，并设置制冷温度：4℃。高压细胞破碎仪冷阱提前循环预冷至4℃；开启高压均质机电源，用1000
±
100ml工艺用水清洗高压均质机管道，设置参数：速度50、压力0-20bar，排尽管路中75％乙醇；然后加入500ml工艺用水清洗管路，然后加入200ml ni-lysis buffer润洗管路后排空，将重悬菌液缓慢倒入高压均质机进样杯中，设置参数：速度50、压力800-1000bar；开始破碎，接收破碎后液体。破碎4-6次，细胞破碎液置于冰浴暂存。破碎完毕后，用2000
±
100ml工艺用水清洗高压均质机管道，用300
±
100ml 75％乙醇清洗高压均质机管道，并保持管道内充满75％乙醇；关闭高压均质机电源，关闭高压均质机制冷系统电源；得到50ml无机焦磷酸酶的上清液。
78.通过实施例三，无机焦磷酸酶湿菌体可以采用高压破碎的方式得到目的蛋白的上清液。
79.实施例4
80.如图1-12所示，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法,检测ni柱亲和层析，包括以下步骤：
81.s1：选取设备包括：小型垂直电泳槽、蛋白纯化系统、化学发光成像分析系统、涡旋仪、恒温金属浴；主要试剂包括：镍琼脂糖凝胶ni hp 50ml、pyrophosphatase ni-binding buffer、pyrophosphatase ni-wash buffer、pyrophosphatase ni-elution buffer、5
×
蛋白上样缓冲液(含dtt)、彩虹180广谱蛋白maker；
82.s2：选取样品为无机焦磷酸酶湿菌体10g；
83.s3；实验：
84.s301：管道清洗
85.对工艺用水、pyrophosphatase ni-binding buffer、pyrophosphatase ni-wash buffer、pyrophosphatase ni-elution buffer超声脱气5分钟处理。
86.将akta的a1、a2、b1、b2、s1和buffer泵头放入工艺用水中，设置pump b2、a2、b1、s1、buffer和a1 pump wash，并执行。
87.s302：系统泵及buffer放置
88.将akta的a1、a2、b1、b2、s1和buffer泵头放入下表buffer中
89.pumpmovingphasesystempumpa1pyrophosphataseni-bindingbuffersystempumpa2pyrophosphataseni-washbuffersystempumpb1pyrophosphataseni-elutionbuffersystempumpb2工艺用水samplepumpbufferpyrophosphataseni-bindingbuffersamplepumps1pyrophosphataseni-bindingbuffer/sample
90.设置pump b2、a2、b1、s1、buffer和a1 pump wash，并执行。设置b2泵流速0.5ml/min，连接层析柱。
91.s303：上样纯化
92.方法设置：流路选择up flow。
93.94.[0095][0096]
管道和纯化柱清洗：流路选择down flow。待实验结束后，将层析柱和所有系统管路依次使用500mm咪唑、工艺用水和20％乙醇清洗，将层析柱及系统管路保存在20％乙醇中，拆下层析柱，连接akta管路，将层析柱4℃保存。
[0097]
通过实施例四，且结合附图3和附图4，ni柱亲和层析可以有效的捕获无机焦磷酸酶目的蛋白，一步层析后，目的蛋白纯度≥90％。
[0098]
实施例5
[0099]
如图1-12所示，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法,检测deae阴离子交换层析，包括以下步骤：
[0100]
s1：选取设备包括：小型垂直电泳槽、蛋白纯化系统、化学发光成像分析系统、涡旋仪、恒温金属浴；主要试剂包括：deae 5ml、pyrophosphatase dilution buffer、pyrophosphatase deae-binding buffer、pyrophosphatase deae-elution buffer、5
×
蛋白上样缓冲液(含dtt)、彩虹180广谱蛋白maker；
[0101]
s2：样片选取为ni柱收集液过滤后上清液，ph：7.5、电导值：10.32ms/cm；
[0102]
s3：实验：
[0103]
s301：管道清洗
[0104]
对工艺用水、pyrophosphatase deae-elution buffer、pyrophosphatase deae-binding buffer、3m kcl分别超声脱气5分钟处理。
[0105]
将akta的a1、a2、b1、b2、s1和buffer泵头放入工艺用水中，设置pump b2、a2、b1、s1、buffer和a1 pump wash，并执行。
[0106]
s302：系统泵及buffer放置
[0107]
将akta的a1、a2、b1、b2、s1和buffer泵头放入下表buffer中
[0108]
pumpmovingphasesystempumpa1pyrophosphatasedeae-bindingbuffersystempumpa2工艺用水systempumpb1pyrophosphatasedeae-elutionbuffersystempumpb23mkclornaclsamplepumpbufferpyrophosphatasedeae-bindingbuffersamplepumps1pyrophosphatasedeae-bindingbuffer/sample
[0109]
设置pump b2、a2、b1、s1、buffer和a1 pump wash，并执行。
[0110]
设置b2泵流速0.5ml/min，连接层析柱。
[0111]
s303：上样纯化
[0112]
方法设置：流路选择up flow。
[0113][0114][0115]
管道和纯化柱清洗：流路选择down flow。待实验结束后，将层析柱和所有系统管路依次使用500mm咪唑、工艺用水和20％乙醇清洗，将层析柱及系统管路保存在20％乙醇
中，拆下层析柱，连接akta管路，将层析柱4℃保存。
[0116]
通过实施例五，且结合附图5和附图6，deae阴离子交换层析可以进一步菁纯无机焦磷酸酶目的蛋白，两步层析后，目的蛋白纯度≥95％；
[0117]
实施例6
[0118]
如图1-12所示，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法,检测g25凝胶过滤层析，包括以下步骤：
[0119]
s1：选取设备包括：小型垂直电泳槽、蛋白纯化系统、化学发光成像分析系统、涡旋仪、恒温金属浴；主要试剂包括：sephadex g-250、pyrophosphatase 2
×
storage buffer、5
×
蛋白上样缓冲液(含dtt)、彩虹180广谱蛋白maker；
[0120]
s2：样品选取为deae收集液过滤后上清液，体积为100ml，分两次上样；
[0121]
s3：实验：
[0122]
s301；管道清洗
[0123]
对工艺用水、pyrophosphatase 2
×
storage buffer超声脱气5分钟处理。
[0124]
将akta的a1、a2、b1、b2、s1和buffer泵头放入工艺用水中，设置pump b2、a2、b1、s1、buffer和a1 pump wash，并执行。
[0125]
s302；系统泵及buffer放置
[0126]
将akta的a1、a2、b1、b2、s1和buffer泵头放入下表buffer中
[0127]
pumpmovingphasesystempumpa12
×
storagebuffersamplepumpbuffer2
×
storagebuffersamplepumps12
×
storagebuffer/samplesystempumpb1depch2osystempumpa20.2mnaohsystempumpb220％乙醇
[0128]
设置pump b2、a2、b1、s1、buffer和a1 pump wash，并执行。
[0129]
设置b2泵流速0.5ml/min，连接层析柱。
[0130]
s303；上样纯化
[0131]
方法设置：流路选择up flow。
[0132]
[0133]
[0134][0135]
管道和纯化柱清洗：流路选择down flow。待实验结束后，将层析柱和所有系统管路依次使用500mm咪唑、工艺用水和20％乙醇清洗，将层析柱及系统管路保存在20％乙醇中，拆下层析柱，连接akta管路，将层析柱4℃保存。
[0136]
通过实施例六，且结合附图7和附图8，g25凝胶过滤层析成功完成了对无机焦磷酸酶的脱盐换液；目的蛋白纯度≥95％。
[0137]
实施例7
[0138]
如图1-12所示，本发明提供了一种无机焦磷酸酶的表达、制备和活性测定方法,检测无机焦磷酸酶活性测定，包括以下步骤：
[0139]
s1：选取主要仪器包括：普通pcr仪、紫外分光光度计；主要试剂包括：nf水、焦磷酸盐、1
×
storage buffer、2
×
焦磷酸酶反应缓冲液、焦磷酸酶、焦磷酸酶、磷酸盐比色分析试剂盒；
[0140]
s2：实验：
[0141]
s201：焦磷酸盐稀释，其浓度比例如下表：
[0142]
焦磷酸盐浓度加入体积nf水体积总体积p01m///p110mm10ulp0990ul1000p50.8mm16ulp1184ul200p60.6mm12ulp1188ul200p70.4mm10ulp1240ul250p80.2mm5ulp1245ul250
[0143]
取8连管每孔加入2
×
反应缓冲液15ul，待测焦磷酸酶原液(s0)10ul，以及稀释好的焦磷酸盐各5ul，最后一孔加入5ul nf水为阴性对照，混匀离心后，普通pcr仪器上反应，25℃，10min，80℃，10min，对焦磷酸酶灭活。每孔补水120ul至体积为150ul后，加入磷酸盐反应液10ul，25℃孵育30min检测a650吸光度值；
[0144]
s202：待测焦磷酸酶稀释，其浓度比例如下表：
[0145]
待测焦磷酸酶浓度加入体积storagebuffer体积总体积j00.1u/ul///j15倍9uls036ul45
[0146]
取8连管酶分别加入2
×
反应缓冲液15ul，稀释好的标准焦磷酸酶(n0)各10ul，分别加入p5-p8的焦磷酸盐各5ul，最后一孔加入10ul 1
×
storage buffer和5ul nf水为阴性对照，混匀离心后，普通pcr仪器上反应，25℃，15min，80℃，10min，对焦磷酸酶灭活。每孔补水120ul至体积为150ul后，加入磷酸盐反应液10ul，25℃孵育30min检测a650吸光度值；
[0147]
s203：neb标准品焦磷酸酶稀释，其浓度如下表：
[0148]
neb焦磷酸酶浓度加入体积storagebuffer体积总体积n00.1u/ul///n15倍9uls036ul45
[0149]
取8连管酶分别加入2
×
反应缓冲液15ul，稀释好的neb焦磷酸酶(n1)各10ul，分别加入p5-p8的焦磷酸盐5ul，最后一孔加入10ul 1
×
storage buffer和5ul nf水为阴性对照，混匀离心后，普通pcr仪器上反应，25℃，15min，80℃，10min，对焦磷酸酶灭活。每孔补水120ul至体积为150ul后，加入磷酸盐反应液10ul，25℃孵育30min检测a650吸光度值；
[0150]
s204：取磷酸盐标准品浓度梯度稀释
[0151]
磷酸盐标准品浓度加入体积nf水体积总体积s010mm///s11mm2uls018ul20
[0152]
在8连管中分别加入1mm的磷酸盐标准品0ul、1ul、2ul、3ul、4ul，分别补nf水150ul、149ul、148ul、147ul、146ul，总体积为150ul。
[0153]
向所有反应孔中加入10ul磷酸盐反应液，混匀离心后之后，25℃孵育30min，体积设置100ul。孵育结束后紫外分光光度计检测650nm吸光度值。
[0154]
磷酸盐标准品a650检测结果如表一：
[0155][0156]
待测和neb焦磷酸酶稀释5倍检测不同量焦磷酸盐a650检测结果如表二：
[0157][0158]
通过实施例七，且结合表一和表二及附图9-12，磷酸盐标准品的检测结果正常，标准曲线线性回归较好，每个检测点的值也在比较小的范围内。
[0159]
从待测和neb焦磷酸酶a650吸光度值检测结果分析，两种酶的活性基本一样，吸光度值大小也合适。从吸光度值构建标准曲线分析，标准曲线线性回归较好。说明可以采用此方法进行自产无机焦磷酸酶的活性测定。