基于全基因组序列的西伯利亚杏CBF基因家族的挖掘与应用

本发明涉及植物分子标记，具体涉及基于全基因组序列的西伯利亚杏cbf基因家族的挖掘与分析方法；再具体的是涉及一组与西伯利亚杏花器官抗冻相关的cbf基因及其应用。

背景技术：

1、西伯利亚杏(prunussibirica)主要分布在我国北方干旱半干旱地区，是集生态、经济和社会效益于一体的“三效合一”重要树种。西伯利亚杏春季萌芽早，易遭晚霜危害。剧烈降温和霜冻会导致西伯利亚杏花、果受冻，造成减产甚至绝收，给生产带来巨大损失。cbf基因家族在植物抵抗逆境特别是抗寒能力方面发挥重要作用。因此，关于西伯利亚杏cbf基因家族的生物信息学和低温胁迫应答分析，对于增强西伯利亚杏及其它林木树种抗冻性，提高果实产量和品质具有重要意义。

2、cbf(c-repeat binding factor/dehydration-responsive element bindingprotein1，cbf/dreb1)属于ap2/erf亚家族中ap2/dreb1(apet-la2/ehylene responsiveelementbinding protein)类转录因子。cbf基因主要受低温胁迫诱导，调控着许多与植物抗寒相关功能基因的表达，通过增强该类基因表达能使植物的抗寒能力得到显著提高。cbf蛋白是由ap2结构域前含pkk/rpagrxkfxetrhp(pkkpagr)序列和后含有dsawr序列组成，且成为区分其它ap2/dreb1类转录因子的特征序列。dreb基因通过结合dre/crt元件调控下游dre/crt启动子元件的抗逆基因表达，从而增强植物抵抗多种逆境和适应能力。研究cbf基因家族的抗逆性(如抗寒，耐旱等)，对提高植物生活力与生产力具有广阔的应用前景。cbf基因家族最早是在拟南芥(arabidopsis thaliana)中被发现，stockinger等首次从拟南芥cdna文库中分离到dre/crt结合蛋白并命名为atcbf1，后续在拟南芥中陆续发现了atcbf2/dreb1c、atcbf3/dreb1a、atcbf4/dreb1d、atcbf5/ddf2/dreb1e和atcbf6/ddf1/dreb1f成员。随后，在毛果杨(populus trichocarpa)、水稻(oryza.sativa)、葡萄(vitisvinifera)、苹果(malus domestica)和桃(prunus persica)等植物中也陆续发现了cbf基因，其cbf成员分别为6个、10个、4个、5个和6个。前人研究表明，拟南芥atcbf1/2/3/4的过表达显著提高了植物对低温的耐受性；4℃冷藏处理能正向诱导五个苹果mdcbfs的表达；桃遭受低温胁迫后，ppcbf1/5/6表达量明显提高。cbf转录因子在植物抗寒性方面的分子功能在许多植物中均已得到鉴定，但目前对西伯利亚杏cbfs基因的鉴定与生物信息学分析还尚未报道。

技术实现思路

1、为此，本发明提供基于全基因组序列的西伯利亚杏cbf基因家族的挖掘与应用，也就是一组与西伯利亚杏花器官抗冻相关的cbf基因及其应用，以解决现未有西伯利亚杏相关抗寒基因研究的问题。

2、本发明利用西伯利亚杏基因组序列信息和生物信息学在线预测网站和软件，对西伯利亚杏cbf家族成员基因和蛋白结构与功能进行分析鉴定。本发明对西伯利亚杏cbf基因家族功能进行全面系统的分析，挖掘出能够改良西伯利亚杏及其它林木在抗冻方面的重要候选基因。

3、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

4、根据本发明第一方面提供的一组与西伯利亚杏花器官抗冻相关的cbf基因，根据通用植物基因命名法，对cbf基因进行了命名分别为pscbf1(paf106g0200010438.01)、pscbf2(paf106g0500019564.01)、pscbf3(paf106g0500019565.01)、pscbf4(paf106g0500019571.01)。

5、进一步的，所述基因前后分别含有pkkpagr和dsawr序列。

6、进一步，所述pscbf1正向引物为5’-cgggagcccaacaagaagac-3’；

7、反向引物为5，-tcaagcaagcagaccgacct-3，。

8、进一步的，所述pscbf2正向引物为5’-tttccagcgacagcagtgat-3’；

9、反向引物为5，-tcctcctcatccgaataaaac-3，。

10、进一步，所述pscbf3正向引物为5’-cgacgacagggtcaccactc-3’；

11、反向引物为5’-tgggctctctcatttcacacac-3’。

12、进一步的，所述pscbf4正向引物为5’-gaccagcccgagtcaagttc-3’；

13、反向引物为5’-cggataagtcccgagccatat-3’。

14、根据本发明第二方面提供的一组与西伯利亚杏花器官抗冻相关的cbf基因在西伯利亚杏抗寒性鉴定中的应用。

15、根据本发明第三方面提供的一组与西伯利亚杏花器官抗冻相关的cbf基因在制备西伯利亚杏抗寒性鉴定试剂盒中的应用。

16、根据本发明第四方面提供的一组与西伯利亚杏花器官抗冻相关的cbf基因在制备单个可检测的cbf基因或基因芯片中的应用。

17、根据本发明第五方面提供的一组与西伯利亚杏花器官抗冻相关的cbf基因的挖掘与分析方法，所述方法是基于全基因组序列数据库。

18、本发明具有如下优点：

19、本发明鉴定出4个pscbfs全部包含cbf家族特有的ap2保守结构域基(pkkpagr和dsawr)，这表明cbf基因家族的高度保守性，推测pscbfs转录因子与其他植物在诸多生长发育和抗逆过程中可能具有相似的功能。

20、本发明发现3个pscbfs含有meja响应元件，表面这些基因可能在ja调控林木抗寒性的通路上发挥一定作用。pscbf2/4均具有低温和分生组织表达响应元件，表面这两个基因可能会在植物组织器官发育起始阶段遭受低温时发挥功能。myb类转录因子参与干旱和极端温度等的多种逆境胁迫应答。pscbf4具有干旱诱导的myb结合位点和光响应myb结合位点，说明该基因将与myb家族成员进行互作共同抵御植物遭受不良环境影响。

21、本发明中4个pscbfs基因主要在抗冻前期(15min)表达量较高，说明西伯利亚杏cbf基因家族都受低温诱导且为早期冻害响应因子。低温胁迫后，它们能快速作出响应来调控下游抗冻基因表达进而发挥重要作用。这与聚类分析和顺式作用元件预测结果较为一致。

22、本发明利用生物信息学方法依据西伯利亚杏全基因组数据库共鉴定出4个cbf家族成员。它们在低温胁迫后均能发挥一定作用。通过预测分析该家族成员还可能参与干旱，高盐等逆境胁迫及分生组织发育过程。这些结果将为今后通过基因工程手段增强西伯利亚杏及其它经济林树种抗逆性，提高果实产量及品质带来重要的参考价值。