一种环化瓜氨酸多肽重组抗原及其制备方法和检测试剂盒与流程

本发明涉及生物学检测，尤其涉及一种环化瓜氨酸多肽重组抗原及其制备方法和检测试剂盒。

背景技术：

1、类风湿性关节炎(ra)是一种系统自身免疫性疾病，常累及周围关节炎及多系统，会对骨关节造成不可逆转的损伤，给患者带来极大的伤害。目前，我国类风湿关节炎发病率可达到0.33％，并且有逐年增加的趋势。因此，早期诊断并积极治疗类风湿性关节炎对提高预后质量具有十分重要的意义。用于诊断ra的主要指标为类风湿因子(rf)，其检测灵敏度可以达到60～80％，但特异性较低，仅能达到60％，并且难以正确区分ra与感染性疾病、重叠疾病等。

2、随着医疗技术的不断发展，临床研究发现环化瓜氨酸多肽(ccp)抗原在类风湿性关节炎诊断中敏感性及特异性均较高，相关研究表明ccp诊断ra的特异性为96％。

3、目前市面上，环瓜氨酸肽抗原大部分为短环肽或者混合肽，或者与载体蛋白欧联获得的耦合蛋白。也有合成的长环肽，如申请人前期授权专利cn113004421b公开的方案，采用化学合成制备得到一个长环肽。但是，这样化学合成的方法不仅成本高、产量也低，难以满足市场需求，且还有诸多限制，例如由于分子量过低或者与bsa偶联后形成混合物无法进行胶体金标记或者化学发光吖叮酯标记。同时在化学合成过程中，一方面由于序列中有多对半胱氨酸残基，而需要定点环化，增大了合成的难度；另一方面，合成后需要进行冻干保存，冻干保存的稳定性差，产品批间差大。

4、此外基于化学合成的工艺，在增加环瓜氨酸肽抗原的位点或增加抗原长度时都会造成高昂成本的进一步提高，也极大限制了抗原的推广。环肽与载体蛋白进行耦连后，由于载体蛋白的大量应用，势必会造成应用时的非特异吸附，也给平台应用造成一些困扰。

5、大肠杆菌重组抗原因生产工艺简单，成本低廉，可以大量的进行推广。一直以来受到高等院校以及企业研发的喜爱，但是在生物体编码子中并没有瓜氨酸编码子，而瓜氨酸又是抗原的一个关键位点，所以环瓜氨酸肽抗原的重组表达之路有了不可逾越的障碍。

6、因此，现有技术有待进一步改进。

技术实现思路

1、针对现有化学合成成本高、特异性低的问题，本技术提供了一种可在大肠杆菌表达系统中进行大批量生产的环化瓜氨酸肽重组抗原，还提供了该重组抗原的制备方法以及环化瓜氨酸肽重组抗原中间体；该环化瓜氨酸多肽重组抗原中间体在大肠杆菌系统中获得表达后，可通过进一步的精氨酸脱亚胺酶处理和环化处理后，得到环化瓜氨酸肽重组抗原。

2、为解决上述问题，本技术的技术方案具体如下：

3、第一方面，本技术提供一种环化瓜氨酸肽重组抗原中间体，该抗原中间体由至少两条多肽x连接而成，相邻的多肽之间通过连接肽l相连，连接肽l的氨基酸序列为(ggggs)4，多肽x的氨基酸序列是将如seq id no.5所示的多肽序列氮源上的部分半胱氨酸替换成谷氨酸而得到,使序列中保留两个半胱氨酸。

4、该重组抗原中间体可在原核表达体系中进行大量表达，极大地提高环化瓜氨酸多肽重组抗原的产量，降低其成本。

5、上述多肽x的氨基酸序列是以申请人之前公开的发明专利cn 113004421b公开的ccp抗原的基础上改进得到的，通过将原序列中的瓜氨酸替换成精氨酸，从而使ccp抗原得以在大肠杆菌中进行顺利转录翻译表达，通过精氨酸脱亚胺酶对表达后的抗原进行瓜氨酸化，进一步增加了抗原特异性。从而使该多肽能在大肠杆菌体系中得到表达，其次，通过连接肽l将至少两条多肽x进行连接，从而使ccp抗原达到多价效果，使抗原位点充分的暴漏，增加检出率。此外，通过将序列中的部分半胱氨酸替换成谷氨酸而得到,使序列中保留两个半胱氨酸，便于后续定点人为成环，增加抗原位点的进一步延展，降低了漏检率。

6、优选地，所述环化瓜氨酸肽重组抗原中间体中，多肽x的数量为两条。这样的中间体的成本较低，且进一步制备得到的重组抗原品质满足要求，可以增加抗原位点的暴漏率，提高特异性。

7、优选地，所述环化瓜氨酸肽重组抗原中间体的氨基酸序列如seq id no.1所示。该序列中，环化瓜氨酸肽重组抗原中间体是由两条多肽x通过连接肽l连接而成，其中第一条多肽x1的c3、c57位的半胱氨酸替换为酸性的谷氨酸e3、e57；第二条多肽x1的c44、c57位的半胱氨酸替换为酸性的谷氨酸e44、e57；实验发现，上述改进的环化瓜氨酸多肽重组抗原中间体进一步处理得到的重组抗原的特异性高，稳定性高。

8、第二方面，本发明还提供一种编码基因，其特征在于，编码上述的环化瓜氨酸肽重组抗原中间体。可根据应用的表达系统(大肠杆菌、酵母菌或其他)的密码子偏爱性特点，将上述环化瓜氨酸肽重组抗原中间体的氨基酸序列分析得到其编码基因，因此，该编码基因并不局限于下述的如seq id no.2所示的序列。

9、优选地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。该序列是针对大肠杆菌表达密码子优化后的核苷酸序列，表达量好。

10、第三方面，本发明还提供一种重组载体，其由克隆载体或表达载体和前述的编码基因重组而成。

11、可选地，所述克隆载体和表达载体采用现有公开的，不限于本技术中的表达载体采用的pet-32a或者pet41a。优选地，表达载体采用促融标签的载体，例如sumo或者gst标签，一方面可以提高重组抗原的表达量，另一方面可以增加表达产物重组抗原的分子量，更利于方法学中的抗原标记。

12、第四方面，本发明还提供一种重组工程菌，所述重组工程菌是向宿主菌中转化前述的重组载体而成。

13、可选地，所述宿主菌为大肠杆菌。大肠杆菌作为宿主用于表达本技术的重组抗原，具有培养成本低、生产工艺简单，易于监控，便于进行大批量生产。

14、第五方面，本发明还提供一种环化瓜氨酸肽重组抗原的制备方法，其包括以下步骤：

15、(1)将前述的环化瓜氨酸肽重组抗原中间体的编码基因序列连接至表达载体，构建重组载体；

16、(2)将上述重组载体转化至宿主菌中，筛选得到重组工程菌；

17、(3)将重组工程菌进行培养并诱导表达，并对产物进行分离和纯化，得到重组抗原中间体；

18、(4)对重组抗原中间体进行精氨酸脱亚胺酶处理，将重组抗原中间体序列中的精氨酸进行瓜氨酸化，在室温下搅拌混合物，使序列中的半胱氨酸残基发生定点环化，最终得到环化瓜氨酸多肽重组抗原。

19、针对大肠杆菌中无法编码瓜氨酸的问题，首先，本技术通过将初始抗原序列中的瓜氨酸替换成精氨酸，从而环化瓜氨酸肽重组抗原中间体可在原核表达系统进行转录翻译表达；并通过后续步骤中对表达产物环化瓜氨酸肽重组抗原中间体进行精氨酸瓜氨酸化处理，得到稳定且特异性高的重组抗原。

20、其次，为了保证重组抗原的定点环化，将该序列中部分半胱氨酸替换成谷氨酸而得到,使序列中保留两个半胱氨酸，便于后续的自动定位环化；为避免该重组蛋白在原核表达过程中不能充分形成二硫键，后续对表达后的重组抗原进行进一步地室温搅拌环化处理(自然氧化处理)达到体外成环的目的，确保了重组抗原充分环化；而上述部分半胱氨酸替换为酸性的谷氨酸的设置，让重组抗原整个氨基酸序列亲水和疏水比例更合理，在大肠杆菌表达系统中不容易错配而降低表达难度，同时也可以增加表达量，利于以后的放大，并且更让人惊喜的是半胱氨酸替换酸性的谷氨酸后，还能提高重组抗原的特异性。

21、此外，本发明将设计调整后的氨基酸序列通过柔性linker(连接肽)进行串联嵌合，不仅增加了重组蛋白的分子量，还让其抗原位点充分暴漏，更容易成环，这样可以减少漏检。

22、更优选的是，给环化瓜氨酸多肽重组抗原中间体序列增加一个促融标签，可选择带有促融标签的表达载体从而满足该要求，例如trx、sumo或者gst标签，这样不仅可以提高重组蛋白的表达量，还可以增加表达重组抗原的分子量，更利于方法学中的抗原标记。

23、优选地，步骤(4)中，精氨酸脱亚胺酶处理条件为：35～38℃水浴孵育1～2h。定点环化处理条件为：室温搅拌过夜。

24、第六方面，本发明还提供一种环化瓜氨酸肽重组抗原，其采用前述的制备方法制备得到。

25、第七方面，本发明还提供一种检测试剂盒，其诊断标记抗原采用前述的环化瓜氨酸肽重组抗原。采用这种检测试剂盒可用于检测样品中的抗瓜氨酸肽抗体，从而应用于风湿性关节炎的检测。

26、本发明具有以下有益效果：

27、1、本技术突破了环化瓜氨酸多肽重组抗原难以在原核表达系统表达的难题，通过巧妙的将抗原序列中的瓜氨酸替换成精氨酸，以及将部分半胱氨酸替换成谷氨酸，不仅使该重组抗原在大肠杆菌中易于表达，还便于其进行人工定点环化，增加抗原位点的进一步延展，降低了漏检率；在此基础上，通过该序列的多倍体通过连接肽进行相连，使ccp重组抗原达到多价效果，使抗原位点充分的暴漏，增加检出率，基于上述改进后得到的重组抗原特异性得到提高，且实现在大肠杆菌的高效表达。

28、2、相对于现有的化学合成类的抗原(如专利cn 113004421b)，本发明提供的ccp大肠杆菌重组抗原的包被效果和检测特异性得到明显提高；更重要的是，本技术的重组抗原的生产工艺简单，成本更低廉，产量更高，经济效益得到显著提高，便于进行工业化大批量生产。

29、3、本发明提供的环化瓜氨酸多肽重组抗原的稳定性好，且特异性和敏感性更高，成本得到大幅度降低。