被保护的HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂的制作方法

被保护的hdac(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂
1.组蛋白的乙酰化/脱乙酰化在真核细胞的转录调控中起着重要作用。组蛋白和非组蛋白蛋白质的乙酰化状态由组蛋白脱乙酰酶(hdac)和组蛋白乙酰转移酶(hat)决定。组蛋白脱乙酰酶(hdac)属于从组蛋白和非组蛋白蛋白质上的赖氨酸基团的ε-氨基部分去除乙酰基基团的酶家族。hdac抑制剂(hdaci)抑制hdac酶的活性—由于hdac的生物学重要性，其抑制具有重要的临床意义，并且hdac抑制已经成为用于治疗癌症、神经退行性疾病、炎性疾病和神经紊乱以及其他的重要治疗策略。
2.hdac酶基于其与酵母组蛋白脱乙酰酶的辅助结构域的同源性进行分类，并且目前被分为四大类：
3..i类，其包括hdac1、hdac2、hdac3和hdac8，与酵母rpd3脱乙酰酶相关；
4.·
iia类，其包括hdac4、hdac5、hdac7和hdac9；iib类，其包括hdac6和hdac10，与酵母hda1(组蛋白脱乙酰酶1)基因相关；
5.·
iii类(还被称为sirtuin)与sir2基因相关并且包括sirt1-7；
6.·
iv类，其仅包含hdac11，具有i类和ii类两者的特征。
7.典型的hdac抑制剂通过结合至hdac的含锌催化结构域而专门作用于i类hdac、ii类hdac和iv类hdac。这些hdac抑制剂可以基于与锌离子结合的化学部分进一步分类(除了用硫醇基团与锌离子结合的环状四肽之外)。实例包括异羟肟酸(或异羟肟酸盐(hydroxamate))，诸如曲古抑菌素a；环状四肽(诸如trapoxin b)，和缩肽；苯甲酰胺；亲电酮，和脂肪酸化合物诸如苯基丁酸盐和丙戊酸。
8.异羟肟酸构成hdac抑制剂的最大类。
9.基于异羟肟酸的hdac抑制剂的实例包括伏立诺他(辛二酰苯胺异羟肟酸，saha)、贝林司他、帕比司他、吉维司他(givinostat)、普雷司他(pracinostat)、奎诺司他(quisinostat)和艾贝司他(abexinostat)。
10.虽然hdac抑制剂具有重要的治疗作用，但是hdac抑制剂诸如异羟肟酸的不稳定性在储存稳定性、溶解度、配制和制造等方面造成了困难。
11.本发明的目的是解决或减轻这些问题中的一个或更多个。本发明的目的是提供被保护的hdac抑制剂，并且特别是被保护的异羟肟酸。本发明的目的是提供可以呈现出改进的稳定性的被保护的hdac抑制剂。本发明的目的是提供可以呈现出改进的溶解度的被保护的hdac抑制剂。本发明的实施方案涉及对hdac抑制剂诸如基于异羟肟酸的hdac抑制剂进行保护和/或脱保护的方法。在实施方案中，脱保护步骤可以在细胞和组织内原位进行，即通过内源性酶进行。
12.发明概述
13.本发明涉及酯作为保护基团的用途。本发明涉及酯作为hdac抑制剂的保护基团的用途。在该过程中，hdac抑制剂的官能团诸如异羟肟基团作为酯被保护。然后，酯可以在酶的存在下去除。酶可以是内源性酶。酯的去除导致官能团的脱保护。这种脱保护可以原位发生，即酶可以是内源性酶，并且脱保护可以在hdac抑制剂进入细胞时发生。细胞可以是哺乳动物细胞。在实施方案中，脱保护在hdac抑制剂经由内源性酶对保护酯基团的作用而进入
靶细胞时发生。这可以导致hdac抑制的原位“清洁”活化。
14.因此，本发明涵盖被保护的hdac抑制剂。被保护的hdac抑制剂可以被酯基团保护。这可以充当前药。它可以作为原位可脱保护的hdac抑制剂。在该实施方案中，被保护的hdac抑制剂在施用之后被代谢为其活性形式。这在储存、配制和制造等方面具有显著的优势。如本文使用的，术语“前药”意指以非活性形式施用的一种或更多种化合物，并且其在体内经由化学过程、生物化学过程或生理过程被转化为其活性形式。
15.有利地，酯可以被选择以允许通过酶促去除仅在靶组织中活化hdac抑制，也就是说，保护基团可以被选择为使得酶促去除仅在那些感兴趣的细胞、组织或身体区域中发生，即在那些包含互补酶的细胞、组织或身体区域中发生。如本领域技术人员将理解的，保护基团可以进一步被调整以调节诸如半衰期、溶解度、靶向性等的特性，以适应靶组织的特性。
16.合适的保护基团包括但不限于：乙酸(c1-c9)酯，羟基乙酸(c1-c9)酯，甲氧基乙酸(c1-c9)酯，苯乙酸酯，丙酸酯，丁酸酯，水杨酸酯，丙酮酸酯，乳酸酯，柠檬酸酯，peg酯，甘油酯，肽酯例如单甘氨酸酯、二甘氨酸酯和三甘氨酸酯，磷酸酯，磺酸酯，碳酸酯例如四甘醇，o-糖基醚，o-糖基酯。
17.在实施方案中，保护基团是乙酸(c1-c9)酯。在实施方案中，保护基团是乙酸c1酯。
18.用于脱保护的合适的酶包括但不限于脂肪酶，乳糖酶，酯酶，淀粉酶，细胞色素p450，糖苷酶例如β-葡萄糖醛酸酶、蔗糖酶和透明质酸酶，肽酶，磷酸酶和硫酸酯酶。
19.在实施方案中，酶是脂肪酶或乳糖酶。
20.在实施方案中，hdac抑制剂是光活性hdac抑制剂，尽管本发明不限于此，并且应当理解，本发明更广泛地适用于hdac抑制剂和hdac抑制剂药物。
21.在实施方案中，hdac抑制剂是光活性hdac抑制剂。“光活性hdac抑制剂”意指具有双重细胞调节活性的hdac抑制剂，所述双重细胞调节活性即光活化的细胞杀伤以及hdac抑制活性诸如生化影响和/或靶向性。
22.这样的化合物的示例性形式在下文示出：
[0023][0024]
这样的hdac抑制剂的实例是如本文公开的化合物。本发明人已经证明，当这样的光活性hdac抑制剂根据本发明被保护时，细胞杀伤功能被维持。已经观察到，生物活性在脱保护发生时被延迟。
[0025]
在本发明的方面中，提供了式i的化合物：
[0026][0027]
其中：
[0028]
r1是h或包含1个至10个碳原子的烷基基团；
[0029]
r2是p-z，其中p是包含从1个至15个碳原子的烷基基团，所述烷基基团任选地被n原子、-c＝o和-nhc＝o中的一个或更多个取代；
[0030]
并且z是：
[0031][0032]
其中r3是h、c
1-c9烷基、-ch2oh、-ch2och3、-ph、-c6h4oh、-ch(ch3)oh、-c(ch2cooh)2oh、-c(＝o)ch3、-ch2nh2、-ch2nh(c＝o)ch2nh2或-ch2nh(c＝o)ch2nh(c＝o)ch2nh2；
[0033]
或者
[0034]
r1和r2形成具有5个或6个成员并被p-z取代的杂环基团y的一部分，其中p是按照上文所定义的，并且其中z是按照上文所定义的；
[0035]
ar1和ar2各自独立地选自苯基、吡啶、嘧啶、噻吩、呋喃、苯并呋喃或噻唑基团；并且
[0036]
x是-c＝c-c(＝o)or4，其中r4是包含从1个至10个碳原子的烷基基团，所述烷基基
团任选地被一个或更多个o原子取代。
[0037]
本发明的化合物具有上文式i中示出的一般结构。
[0038]
具有5个或6个成员的术语杂环基团意指这样的单环基团，所述单环基团包含5个或6个环成员并且任选地除了式i氮原子之外还包含一个或更多个选自由n、s、so、so2、o2和o组成的组的杂原子。术语“杂环基团”包括芳香族的、部分不饱和的和饱和的环体系。非芳香族基团的实例包括哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、二氧硫代吗啉基、吡咯烷-1-基和吡咯烷-3-基基团，但不限于此。芳香族(杂芳基)基团的实例包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吲哚基和苯并噻二唑基基团，但不限于此。在实施方案中，杂环基团是饱和的环体系。根据式i，环体系被p-z取代。在实施方案中，p-z相对于式i氮原子处于4位。
[0039]
如本文使用的，术语“烷基”指的是完全饱和的、支化的、未支化的或环状的烃部分，即伯烷基、仲烷基或叔烷基，或者，在适当的情况下，环烷基或被环烷基取代的烷基。在没有另外指示的情况下，烷基基团包含从1个至10个碳原子，优选地从1个至6个碳原子，或更优选地1个至4个碳原子。代表性的烷基基团包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。
[0040]
在实施方案中，r3是c
1-c6烷基。
[0041]
在实施方案中，r3是c
1-c3烷基。在实施方案中，r3是-ch3。
[0042]
在实施方案中，ar1是噻唑或苯基基团。
[0043]
在实施方案中，ar2是吡啶、噻吩或呋喃基团。
[0044]
在实施方案中，ar1选自噻唑或苯基基团，并且ar2选自吡啶、噻吩或呋喃基团。
[0045]
在实施方案中，r1和r2形成杂环基团y的一部分。杂环基团y被p-z取代，其中p是包含从1个至15个碳原子的烷基基团，所述烷基基团任选地被n原子、-c＝o和-nhc＝o中的一个或更多个取代；并且z是：
[0046][0047]
其中r3是h、c
1-c9烷基、-ch2oh、-ch2och3、-ph、-c6h4oh、-ch(ch3)oh、-c(ch2cooh)2oh、-c(＝o)ch3、-ch2nh2、-ch2nh(c＝o)ch2nh2或-ch2nh(c＝o)ch2nh(c＝o)ch2nh2。
[0048]
在实施方案中，取代基p-z相对于式i氮原子处于4位。
[0049]
在其中r1和r2形成杂环基团y的一部分的实施方案中，y是哌嗪。
[0050]
y可以是：
[0051][0052]
当y是哌嗪时，p可以是被-c(＝o)取代的c
1-c
15
烷基基团。在实施方案中，p是-c(＝o)(ch2)6。
[0053]
在式i中，x是-c＝c-c(＝o)or4，其中r4是包含从1个至10个碳原子的烷基基团，所述烷基基团任选地被一个或更多个o原子取代。
[0054]
在实施方案中，r4是c
1-c6烷基基团。
[0055]
在实施方案中，r4是-ch3、-c(ch3)3或-ch2ch(ch3)2。
[0056]
任选地，r1和r2不形成杂环基团y。在该实施方案中，r1是h或包含1个至10个碳原子的烷基基团；并且r2是p-z，其中p是包含从1个至15个碳原子的烷基基团，所述烷基基团任选地被n原子、-c＝o和-nhc＝o中的一个或更多个取代；
[0057]
并且z是：
[0058][0059]
其中r3是h、c
1-c9烷基、-ch2oh、-ch2och3、-ph、-c6h4oh、-ch(ch3)oh、-c(ch2cooh)2oh、-c(＝o)ch3、-ch2nh2、-ch2nh(c＝o)ch2nh2或-ch2nh(c＝o)ch2nh(c＝o)ch2nh2。在该实施方案中，r1可以是c
1-c3烷基。在实施方案中，r1是-ch3。
[0060]
当r2是p-z时，p可以是被-nhc(＝o)取代的c
1-c
15
烷基。
[0061]
在实施方案中，p是-(ch2)5nhc(＝o)(ch2)6。
[0062]
在实施方案中，r4是-(ch2ch2o)nch3，其中n是在1和8之间的整数。在实施方案中，r4是-(ch2ch2o)3ch3。
[0063]
在实施方案中，r4是-(ch2ch2o)nch3，其中n是在1和8之间的整数，优选地r4是-(ch2ch2o)3ch3，并且r1和r2不形成杂环基团。
[0064]
在实施方案中，式i的化合物选自化合物92、化合物93、化合物101和化合物102：
[0065]
[0066][0067]
根据本发明的化合物固有地是发荧光的。根据本发明，化合物可以用于荧光成像。
[0068]
在方面中，本发明涉及式i的化合物在所述化合物被光活化时产生活性氧物质(ros)的用途。
[0069]
三重态光敏剂(ps)通常包含光收集区，所述光收集区负责光收集和系统间交叉的双重功能，其中处于单重态的电子非辐射地传递到三重态。三重激发态的猝灭可以导致活性氧物质(ros)(来自基态分子氧的自由基)的形成或与周围分子的直接化学反应。局部ros产生是一种免疫防御策略，其被用于动物系统和植物系统两者中，以应对病原体攻击。在动物、植物、真菌和细菌的细胞中，ros取决于其产生的速率和程度而引发多种调节作用；在高浓度，观察到凋亡，而在低浓度，经常观察到刺激性反应(guo等人stem cells dev.2010,19,1321-1331)。
[0070]
光动力疗法(pdt)利用光敏剂产生ros的能力，通常通过凋亡来破坏癌细胞、病原微生物和/或不需要的组织。通常，光敏化合物在特定的靶组织或状况(例如，微生物感染、肿瘤形成、肿瘤等)附近/内部被激发，导致产生大量的ros并且随后破坏该组织。在低水平的ros，细胞增殖可以被触发，导致在伤口愈合或更一般的组织再生疗法中的应用。
[0071]
因此，pdt依靠光敏化合物的靶向性以积累在期望的位置(诸如，患病组织的细胞)，以及局部光递送以激活ros产生。虽然用于pdt的化合物是已知的，但它们通常具有多种缺点，包括小的吸收峰，导致光活化困难，特别是对于可能难以实现光渗透的大肿瘤(bulky tumor)；长的生物半衰期，导致治疗后持续延长的时间段的皮肤光敏性；差的药理学性质，诸如差的水溶性；以及差的靶向能力(即，靶向特定组织或特定细胞和在特定组织
或特定细胞中积累的差的能力，导致显著的脱靶损伤)。
[0072]
有利地，本发明的化合物在未活化的状态下是生物惰性的，但当用低至中等能量的短波长可见光辐照时产生ros。
[0073]
因此，式i的化合物可以用于产生活性氧物质(ros)，并且从而控制细胞发展，即控制细胞的增殖、分化和凋亡，导致多种治疗用途和非治疗用途。式i的化合物特别有利于在由ros的控制介导的应用中使用，因为它们展示出有效的靶向，这可以导致较少的脱靶效应。它们还可以被调整到不同的细胞类型，允许实现选择性靶向作用。
[0074]
因此，在方面中，本发明涉及本发明的化合物或缀合物在光动力疗法(pdt)中的用途。
[0075]
ros的产生可以基于治疗需求来控制，例如，以诱导用于细胞消融的凋亡，在伤口愈合中引起增殖，或这些的组合。例如在伤口护理中，高水平的ros可以最初被触发，导致细菌和/或真菌的细胞的凋亡，随后是低水平的ros以帮助皮肤再生。
[0076]
因此，本发明涉及治疗患有受益于hdac抑制的疾病或状况的患者的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的式i的化合物或其缀合物，其中式i的化合物在体内被代谢为其活性形式。
[0077]
在方面中，本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含式i的化合物，该式i的化合物任选地与一种或更多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合。
[0078]
有利地，式i的化合物作为酯被保护，这赋予化合物稳定性。被保护的化合物更容易储存。被保护的化合物可以呈现出改进的溶解度。化合物的活化涉及保护基团的去除。
[0079]
本发明的方面涉及使式i的化合物脱保护的方法，该方法包括使式i的化合物与酶接触。
[0080]
酶可以是内源性酶。用于脱保护的合适的酶包括但不限于脂肪酶，乳糖酶，酯酶，淀粉酶，细胞色素p450，糖苷酶例如β-葡萄糖醛酸酶、蔗糖酶和透明质酸酶，肽酶，磷酸酶，硫酸酯酶。
[0081]
在实施方案中，酶是脂肪酶或乳糖酶。
[0082]
有利地，酯保护基团可以被选择以允许通过酶促去除仅在靶组织中活化hdac抑制，也就是说，保护基团可以被选择为使得酶促去除仅在那些感兴趣的细胞、组织或身体区域中发生，即在那些包含互补酶的细胞、组织或身体区域中发生。如本领域技术人员将理解的，保护基团可以进一步被调整以调节诸如半衰期、溶解度、靶向性等的特性，以适应靶组织的特性。
[0083]
合适的保护基团包括但不限于：乙酸(c1-c9)酯，羟基乙酸(c1-c9)酯，甲氧基乙酸(c1-c9)酯，苯乙酸酯，丙酸酯，丁酸酯，水杨酸酯，丙酮酸酯，乳酸酯，柠檬酸酯，peg酯，甘油酯，肽酯例如单甘氨酸酯、二甘氨酸酯和三甘氨酸酯，磷酸酯，磺酸酯，碳酸酯例如四甘醇，o-糖基醚，o-糖基酯。
[0084]
在实施方案中，保护基团是乙酸(c1-c9)酯。当酯保护基团是c1乙酸酯时，式i的化合物中的r3是-ch3。
[0085]
根据本发明的方面，提供了一种使式i的化合物脱保护的方法，该方法包括在溶剂的存在下使式i的化合物与碱反应。
[0086]
用于本发明的方法的合适的碱包括naoh、lioh、koh、li2co3、na2co3、k2co3、cs2co3、
liome、naome、kome、lioet、naoet、koet、lio
t
bu和ko
t
bu。
[0087]
溶剂可以是极性溶剂。合适的溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、丁醇正醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、水、四氢呋喃、1,4-二噁烷、乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺和二甲基亚砜。
[0088]
该方法可以在从5℃至100℃或从15℃至30℃进行。有利地，该方法可以在室温进行。
[0089]
反应可以进行持续从30分钟至48小时。在实施方案中，反应进行持续从1小时至12小时或从2小时至7小时。
[0090]
在反应发生后，反应混合物可以使用本领域技术人员已知的技术进行后处理(work up)。例如，可以将反应混合物稀释，并且将合并的有机物洗涤和干燥并且蒸发，以给出作为粗制固体的脱保护的化合物。
[0091]
因此，本发明涉及被保护的hdac抑制剂，其实例包括以下化合物：
[0092][0093][0094]
在实施方案中，被保护的hdac抑制剂是化合物92、化合物93、化合物101或化合物102。
[0095]
在实施方案中，被保护的hdac抑制剂是化合物92、化合物93或化合物101。
[0096]
用作对照化合物的相关化合物包括下文的化合物12、化合物13和化合物14：
[0097][0098]
本发明的方面涉及一种使式i的化合物脱保护的方法，该方法包括在溶剂的存在下使式i的化合物与碱反应。该方法任选地包括纯化步骤。
[0099]
本发明涉及一种将hdac抑制剂作为酯进行保护并且用酯酶去除酯以活化hdac抑制的方法。酯酶可以是内源性酯酶。用酯酶去除酯可以在体内进行。
[0100]
本发明涉及一种治疗由hdac抑制介导的紊乱或状况的方法，该方法包括施用如本文描述的被保护的hdac抑制剂，其中hdac抑制剂随后被原位脱保护。
[0101]
式i的化合物与其脱保护的对应物相比可以有利地呈现出增加的溶解度、改进的化学稳定性和储存稳定性以及易于制造(图1)。
实施例：
[0102]
现在将参考附图仅通过实例的方式来描述本发明，在附图中：
[0103]
图1示出了本发明的示意图，其中pg指示保护基团；
[0104]
图2示出了乙酸酯保护的异羟肟酸(88)的示例性合成；
[0105]
图3示出了根据本发明的具有光活化的细胞杀伤活性的被保护的hdac抑制剂(92)的示例性合成；
[0106]
图4示出了根据本发明的具有光活化的细胞杀伤活性的可选择的被保护的hdac抑制剂(93)的示例性合成；
[0107]
图5示出了构建块化合物(building block compound)(96)的合成；
[0108]
图6示出了构建块化合物(99)的合成；
[0109]
图7示出了光活化的化合物(100)的合成；
[0110]
图8示出了示例性化合物(101)的合成；
[0111]
图9示出了荧光素二乙酸酯细胞生存力测定的结果，该测定测量了响应于在具有和没有辐照的情况下用化合物92处理，hacat角质形成细胞的生存力；
[0112]
图10示出了hacat角质形成细胞的免疫荧光成像，所述hacat角质形成细胞用化合物92和etoh处理并且用检测乙酰化的h3组蛋白的存在的抗乙酰基-h3一级抗体共处理；
[0113]
图11示出了响应于用根据本发明的化合物93以及用对照化合物处理15分钟和一小时之后，scc-4细胞中乙酰基-h3的丰度；
[0114]
图12示出了响应于用根据本发明的化合物93和化合物101以及用对照化合物处理1小时之后，scc-4细胞中乙酰基-h3的丰度；
[0115]
图13示出了响应于用根据本发明的化合物92以及用对照化合物处理15分钟之后，scc-4细胞中乙酰基-h3的丰度；
[0116]
图14示出了相对于对照，在光活化之前和之后在用50nm的化合物93和100nm的化合物93处理之后，hacat细胞中胱天蛋白酶-3的表达水平；
[0117]
图15示出了展示化合物101的共定位的荧光显微术图像；
[0118]
图16示出了展示化合物93的共定位的荧光显微术图像；
[0119]
图17示出了化合物93的示例性脱保护。
[0120]
实验实施例：
[0121]
一般方法：
[0122]
所有光辐照都使用改良的photoreact 365
tm
进行，所述改良的photoreact 365
tm
在5分钟内以29mw/cm2的功率发射405nm的光。所有图像分析都使用imagej软件进行，并且所有图都使用prism制作。
[0123]
细胞生存力测定：
[0124]
将不透明壁96孔板以每孔20,000个scc-4细胞接种。第二天，在辐照“光”处理的板之前，将板用一系列浓度(100pm
–
1μm)的感兴趣的化合物处理持续1小时。接下来的一天，将板：
[0125]
·
用碘化丙锭(pi)和荧光素二乙酸酯(fda)处理持续10分钟，然后在pbs中洗涤，之后在535/617nm处测量pi的荧光和在485/520nm处测量fda的荧光。
[0126]
·
用12mm mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)溶液处理持续2小时，然后在轨道振荡器上在dmso中裂解，并且测量在540nm处的吸光度。
[0127]
·
用xtt(2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2h-四唑鎓-5-甲酰苯胺)标记试剂和电子偶联试剂处理持续4小时，然后用pbs洗涤并测量在650nm处的吸光度。
[0128]
·
在轨道振荡器上用celltitre-glo
tm
试剂处理持续10分钟以使细胞裂解，然后测量发光。
[0129]
显微术程序：
[0130]
共定位
[0131]
将scc-4细胞以每孔50,000个细胞接种在8孔室载玻片上，并且接下来的一天，用1μm感兴趣的化合物处理持续1小时，然后用4％多聚甲醛(pfa)固定或将培养基更换为活细胞成像溶液。将共染色剂(例如mitotracker、bodipy er tracker或lipidspot 610)应用持续30分钟，然后在zeiss lscm 880上成像。
[0132]
免疫荧光
[0133]
将hacat细胞或scc-4细胞以每孔50,000个细胞接种在包含6孔板的无菌盖玻片中。第二天，将细胞用感兴趣的化合物处理持续30分钟，然后辐照“光”处理的细胞。接下来的一天，细胞然后使用4％ pfa固定，使用triton x-100/吐温20透化，在bsa/山羊血清中封闭(取决于抗体)，并且用一级抗体然后二级抗体染色，然后将盖玻片安装在载玻片上并在zeiss lscm 880上成像。
[0134]
免疫沉淀
[0135]
将scc-4细胞以每孔350,000个细胞接种在6孔板中，并且接下来的一天，将细胞用感兴趣的化合物处理。在所需的孵育之后，辐照“光”处理的细胞，并且所有细胞都使用ripa缓冲液裂解。进行sds-page，并且在封闭和一级抗体然后二级抗体染色之前将蛋白质转移到硝化纤维素/pvdf膜上。使用ibright成像系统对化学发光信号进行成像。
[0136]
实施例1：乙酸酯保护的异羟肟酸88的合成
[0137]
示例性的乙酸酯保护的异羟肟酸88的合成在图2中示出，并且在下文的实施例1.1至实施例1.4中进一步描述。
[0138]
实施例1.1
[0139]
8-甲基辛二酸1-叔丁酯85的合成
[0140]
将化合物47(33.0g，175mmol)溶解在叔丁醇(250ml)中并冷却至0℃，随后添加二碳酸二叔丁酯(57.3g，262.5mmol)和4-二甲基氨基吡啶(6.4g，52.5mmol)，并且将所得到的悬浮液在室温快速搅拌持续2h。将溶液用5％hcl稀释并且用二氯甲烷(dcm)提取(3x)。将有机物用饱和的nh4cl和h2o洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制红色油状物(58.9g)。这通过sio2色谱法(己烷/乙酸乙酯(etoac)，9:1)纯化，以给出作为无色油状物的化合物85(29.06g，68％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.28
–
1.35(m,4h),1.43(s,9h),1.54
–
1.65(m,4h),2.19(t,j＝7.5hz,2h),2.29(t,j＝7.5hz,2h),3.65(s,3h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ24.7,24.9,28.1,28.7,28.8,34.0,35.5,51.4,79.9,173.1,174.2。
[0141]
实施例1.2
[0142]
7-(羟基氨基甲酰基)庚酸叔丁酯86的合成
[0143]
将化合物85(6.1g，25.0mmol)溶解在甲醇(meoh)(21ml)中，随后添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)(11.2ml，75.0mmol)和羟胺(nh2oh)(50％水溶液，15.3ml，250mmol)，并且将所得到的溶液在室温(rt)搅拌持续3h。将混合物用二氯甲烷(dcm)稀释，并且将有机物用5％hcl和h2o洗涤、干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制黄色油状物(3.23g)。这通过sio2色谱法(二氯甲烷/甲醇，9:1)纯化，以给出作为无色油状物的化合物86(2.34g，38％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.26
–
1.37(m,4h),1.43(s,9h),1.52
–
1.68(m,4h),2.14(s,2h),2.19(t,j＝6.9hz,2h)。
[0144]
实施例1.3
[0145]
7-[(乙酰氧基)氨基甲酰基]庚酸叔丁酯87的合成
[0146]
将化合物86(2.3g，9.37mmol)溶解在二氯甲烷(40ml)中，随后添加乙酰氯(0.8ml，11.24mmol)和三乙胺(1.56ml，11.24mmol)，并且将所得到的溶液在室温搅拌持续3h。将溶液用二氯甲烷稀释，并且将有机物用饱和的nh4cl和h2o洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制浅黄色油状物(2.75g)。这通过sio2色谱法(二氯甲烷/甲醇，99:1)纯化，以给出作为无色油状物的化合物87(1.65g，61％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.24
–
1.37(m,4h),1.39(s,9h),1.48
–
1.58(m,2h),1.59
–
1.69(m,2h),2.13
–
2.19(m,2h),2.17(s,3h),2.18
–
2.23(m,2h),9.64(s,1h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ18.2,24.7,28.0,28.4,28.5,32.6,35.3,80.1,168.7,173.3；ms(es)：m/z＝288.2[m+h]
+
；hrms(es)对于c
14h26
no5[m+h]
+
的计算值：288.1805，实测值：288.1801。
[0147]
实施例1.4
[0148]
7-[(乙酰氧基)氨基甲酰基]庚酸88的合成
[0149]
将化合物87(1.65g，5.74mmol)溶解在二氯甲烷(60ml)中，随后添加三氟乙酸(tfa)(5ml，65mmol)，并且将所得到的溶液在室温搅拌持续18h。将溶液蒸发，并且粗制残余物通过sio2色谱法(二氯甲烷/甲醇，95:5)纯化，以给出作为白色固体的化合物88(1.10g，83％)：1h nmr(700mhz,dmso-d6)δ1.23
–
1.28(m,4h),1.45
–
1.52(m,4h),2.09(t,j＝7.4hz,
2h),2.13(s,3h),2.18(t,j＝7.4hz,2h),11.53(br,1h),11.95(br,1h)；
13
c nmr(176mhz,dmso-d6)δ18.1,24.3,24.6,28.1,28.2,31.8,33.6,168.5,169.7,174.4；ms(es)：m/z＝232.1[m+h]
+
；hrms(es)对于c
10h18
no5[m+h]
+
的计算值：232.1179，实测值：232.1167。
[0150]
实施例2：被保护的hdac抑制剂92的合成
[0151]
具有光活化的细胞杀伤活性的示例性的被保护的hdac抑制剂92的合成在图3中示出，并且在下文的实施例2.1至实施例2.4中进一步描述。
[0152]
实施例2.1：
[0153]
4-(5-溴-1,3-噻唑-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯89的合成
[0154]
将2,5-二溴-1,3-噻唑(10g，41.2mmol)溶解在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(100ml)中，随后添加1-boc-哌嗪(10g，53.5mmol)和k2co3(7.40g，53.5mmol)，并且将所得到的混合物在70℃搅拌持续72h。将混合物冷却，用h2o稀释并用乙酸乙酯提取。将有机物用h2o和盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制油状物。这通过sio2色谱法(石油醚/乙酸乙酯，8:2)纯化，以给出作为浅黄色固体的化合物89(10.5g，74％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.46(s,9h),3.38
–
3.41(m,4h),3.52
–
3.55(m,4h),7.06(s,1h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ28.3,48.0,80.4,95.2,140.4,154.5,171.5。
[0155]
实施例2.2：
[0156]
1-(5-溴-1,3-噻唑-2-基)哌嗪90的合成
[0157]
将化合物89(10.45g，30.0mmol)溶解在二氯甲烷(100ml)中，随后添加三氟乙酸(9.2ml，120.0mmol)，并且将所得到的溶液在室温搅拌过夜。将溶液蒸发，以给出粗制黄色油状物(23g)。这通过sio2色谱法(二氯甲烷/甲醇，95:5)纯化，以给出期望的化合物的三氟乙酸盐(10.7g)。随后将其溶解在二氯甲烷中并且用饱和的nahco3快速搅拌持续0.5h。将有机物用h2o洗涤、干燥(mgso4)并蒸发，以给出作为白色固体的化合物90(6.15g，83％)：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ2.73
–
2.77(m,4h),3.24
–
3.27(m,4h),7.18(s,1h)；ms(es)：m/z＝248.0,250.0[m+h]
+
；hrms(es)对于c7h
11
n3sbr[m+h]
+
的计算值：247.9852，实测值：247.9850。
[0158]
实施例2.3：
[0159]
(2e)-3-(5-{2-[2-(哌嗪-1-基)-1,3-噻唑-5-基]乙炔基}吡啶-2-基)丙-2-烯酸甲酯91的合成
[0160]
三乙胺(et3n)(200ml)通过用ar鼓泡持续1h来脱气。然后在ar下添加化合物90(2.80g，11.3mmol)、化合物42(2.32g，12.41mmol)、pd(pph3)2cl2(390mg，0.18mmol)和cui(107mg，0.18mmol)，并且将所得到的悬浮液在60℃搅拌持续72h。然后将溶剂蒸发，以给出粗制固体，该粗制固体通过sio2色谱法(95:5至9:1，二氯甲烷/甲醇，1％三乙胺)纯化两次，以给出作为亮橙色固体的化合物91(2.28g，57％)：1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ2.75
–
2.82(m,4h),3.35
–
3.41(m,4h),3.75(s,3h),6.91(d,j＝15.7hz,1h),7.58(s,1h),7.69(d,j＝15.7hz,1h),7.79(dd,j＝8.1,0.9hz,1h),7.96(dd,j＝8.1,2.2hz,1h),8.72(dd,j＝2.2,0.9hz,1h)；ms(es)m/z＝355.1[m+h]
+
；hrms(es)对于c
18h19
n4o2s[m+h]
+
的计算值：355.1223，实测值：355.1223。
[0161]
实施例2.4：
[0162]
(2e)-3-(5-{2-[2-(4-{7-[(乙酰氧基)氨基甲酰基]庚酰基}哌嗪-1-基)-1,3-噻
唑-5-基]乙炔基}吡啶-2-基)丙-2-烯酸甲酯92的合成
[0163]
将化合物88(0.39g，1.69mmol)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(0.32g，1.85mmol)在0℃溶解在二氯甲烷(30ml)中，随后在5min内逐滴添加4-甲基吗啉(0.20ml，1.85mmol)。将所得到的混合物在0℃搅拌持续2h，随后添加化合物91(0.5g，1.41mmol)和4-甲基吗啉(0.19ml，1.68mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续18h。将混合物用二氯甲烷稀释，用h2o洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制黄色固体(1.7g)。这通过sio2色谱法(99:1，二氯甲烷/甲醇)纯化，并且进一步从乙腈(mecn)中重结晶，以给出作为黄色固体的化合物92(0.53g，66％)：1h nmr(700mhz,cdcl3)δ1.35
–
1.44(m,4h),1.64
–
1.68(m,2h),1.69
–
1.73(m,2h),2.22(s,3h),2.26(t,j＝7.4hz,2h),2.39(t,j＝7.4hz,2h),3.50(t,j＝5.4hz,2h),3.58
–
3.65(m,4h),3.78(t,j＝5.4hz,2h),3.82(s,3h),6.93(d,j＝15.6hz,1h),7.38(dd,j＝8.2,0.9hz,1h),7.45(s,1h),7.66(d,j＝15.6hz,1h),7.74(dd,j＝8.1,2.1hz,1h),8.69(dd,j＝2.1,0.8hz,1h),9.32(s,1h)；
13
c nmr(176mhz,cdcl3)δ18.3,24.7,28.1,28.3,32.5,32.8,40.6,44.7,48.0,48.4,51.9,85.4,91.2,106.6,120.7,122.5,123.5,138.3,142.7,146.0,151.3,151.9,167.1,171.5,171.8；ms(es)：m/z＝568.2[m+h]
+
；hrms(es)对于c
28h34
n5o6s[m+h]
+
的计算值：568.2224，实测值：568.2220。
[0164]
实施例3：被保护的hdac抑制剂93的合成
[0165]
(2e)-3-(5-{2-[4-(4-{7-[(乙酰氧基)氨基甲酰基]庚酰基}哌嗪-1-基)苯基]乙炔基}噻吩-2-基)丙-2-烯酸叔丁酯93的合成在图4中示出，并且在下文详述。
[0166]
将化合物88(2.89g，12.5mmol)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(2.39g，13.6mmol)在0℃溶解在二氯甲烷(100ml)中，随后在5min内逐滴添加4-甲基吗啉(1.5ml，13.6mmol)。将所得到的混合物在0℃搅拌持续2h，随后添加化合物27(4.11g，10.41mmol)和4-甲基吗啉(1.36ml，12.4mmol)，并且将混合物在室温搅拌持续18h。将混合物用二氯甲烷稀释，用h2o洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制黄色固体(1.7g)。这通过sio2色谱法(97:3，二氯甲烷/甲醇)纯化，并且进一步从乙腈中重结晶，以给出作为黄色固体的化合物93(2.51g，40％)：1h nmr(600mhz,cdcl3)δ1.32
–
1.45(m,4h),1.50(s,9h),1.63(p,j＝7.1hz,2h),1.69(p,j＝7.1hz,2h),2.19(s,3h),2.25(t,j＝7.2hz,2h),2.37(t,j＝7.5hz,2h),3.21(t,j＝5.3hz,2h),3.24(t,j＝5.3hz,2h),3.55
–
3.66(m,2h),3.75(t,j＝5.2hz,2h),6.11(dd,j＝15.6,1.1hz,1h),6.84(d,j＝8.7hz,2h),7.03
–
7.14(m,2h),7.36
–
7.44(m,2h),7.58(d,j＝15.6hz,1h),9.91(s,1h)；
13
c nmr(176mhz,cdcl3)δ18.3,24.8,28.1,28.2,28.4,32.4,32.7,41.1,45.2,48.1,48.4,53.4,80.6,81.3,96.0,112.9,115.3,119.2,126.1,130.6,132.0,132.7,135.4,140.2,150.6,165.9,168.7,171.8。
[0167]
实施例4：构建块化合物96的合成
[0168]
n-(5-氨基戊基)-4-碘-n-甲基苯胺96的合成在图5中示出，并且在下文详述。
[0169]
实施例4.1：
[0170]
5-氯-n-(4-碘苯基)-n-甲基戊酰胺94的合成
[0171]
将n-甲基-4-碘苯胺(24.04g，103mmol)溶解在二氯甲烷(300ml)中，并且将溶液冷却至0℃。添加5-氯戊酰氯(14.6ml，113.3mmol)，然后添加吡啶(9.16ml，113.3mmol)，并且将所得到的溶液在室温搅拌持续16h。将溶液用二氯甲烷稀释，并且将有机物用饱和的nh4cl和h2o洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制棕色油状物(40g)。这通过sio2色谱法(7:
3环己烷/乙酸乙酯)纯化，以给出作为黄色油状物的化合物94(35.16g，97％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.57
–
1.79(m,4h),1.98
–
2.19(m,2h),3.24(s,3h),3.35
–
3.52(m,2h),6.93(d,j＝7.9hz,2h),7.75(d,j＝8.0hz,2h)。
[0172]
实施例4.2：
[0173]
5-叠氮基-n-(4-碘苯基)-n-甲基戊酰胺95的合成
[0174]
将化合物94(35.0g，99.5mmol)溶解在n,n-二甲基甲酰胺(200ml)，并且添加叠氮化钠(13.53g，208.95mmol)，随后将溶液在80℃搅拌持续18h。将悬浮液冷却，用h2o稀释，并且然后用etoac提取。将有机物用h2o和盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制橙色油状物(37.6g)。这通过sio2色谱法(7:3环己烷/乙酸乙酯)纯化，以给出作为橙色油状物的化合物95(33.4g，94％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.45
–
1.59(m,2h),1.61
–
1.69(m,2h),1.91
–
2.20(m,2h),3.10
–
3.36(m,5h),6.85
–
7.02(m,2h),7.67
–
7.84(m,2h)。
[0175]
实施例4.3：
[0176]
n-(5-氨基戊基)-4-碘-n-甲基苯胺96的合成
[0177]
将化合物95(5.24g，14.6mmol)溶解在甲苯(80ml)，并且添加bh3.me2s(在甲苯中的2.0m，16.8ml，33.6mmol)，随后将溶液在回流下搅拌持续16h。将混合物冷却，然后用10％w/v na2co3水溶液搅拌持续0.5h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并且将有机物用h2o和盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制黄色油状物(4.21g)。这通过sio2色谱法(9:1二氯甲烷/甲醇，2％三乙胺)纯化，以给出作为澄清油状物的化合物96，其直接进行下一步骤(1.76g，38％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.28
–
1.39(m,2h),1.43
–
1.53(m,2h),1.53
–
1.61(m,2h),1.97(s,2h),2.70(t,j＝7.0hz,2h),2.88(s,3h),3.21
–
3.32(m,2h),6.41
–
6.47(m,2h),7.39
–
7.46(m,2h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ24.3,26.4,33.1,38.2,41.9,52.5,76.4,114.3,137.6,148.7。
[0178]
实施例5：构建块化合物99的合成
[0179]
2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基(2e)-3-(5-乙炔基噻吩-2-基)丙-2-烯酸酯的合成在图6中示出，并且在下文详述。
[0180]
实施例5.1：
[0181]
5-碘噻吩-2-甲醛24的合成
[0182]
在50℃，向在乙醇(50ml)中的2-噻吩甲醛(9.34ml,100.0mmol)的溶液中添加n-碘代琥珀酰亚胺(24.75g，110.0mmol)和对甲苯磺酸一水合物(1.90g，10.0mmol)，随后将所得到的溶液在50℃搅拌持续1h。添加1.0mhcl(80ml)，并且将混合物用乙酸乙酯提取，用饱和的na2s2o3、h2o和盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出作为缓慢结晶的黄色油状物的化合物24(25.26g，》100％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.39(s,2h),9.77(s,1h)。
[0183]
实施例5.2：
[0184]
5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙炔基]噻吩-2-甲醛97的合成
[0185]
三乙胺(300ml)通过用氩气鼓泡持续1h来脱气。然后在氩气下添加化合物24(25g，105mmol)、三甲基甲硅烷基乙炔(16.0ml，115.5mmol)、pd(pph3)2cl2(740mg，1.05mmol)和cui(200mg，1.05mmol)，并且将所得到的悬浮液在室温搅拌持续18h。将混合物用二乙醚稀释并通过硅藻土/sio2，以给出粗制棕色油状物(17.7g)。这通过sio2色谱法纯化，以给出作为缓慢结晶的橙色油状物的化合物97(12.79g，58％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.25(s,9h),
7.24(d,j＝4.0hz,1h),7.60(d,j＝4.0hz,1h),9.83(s,1h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ-0.5,26.9,96.3,104.6,132.5,133.1,135.7,143.8,182.4；ir(atr)v
max
/cm-1 2960w,2899w,2833w,2148m,1666s,1438s,1249s,1223s,1207s,838s；ms(es)m/z＝209.0[m+h]
+
；hrms(es)对于c
10h13
sosi[m+h]
+
的计算值：209.0451，实测值：209.0454。
[0186]
实施例5.3：
[0187]
(2e)-3-{5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙炔基]噻吩-2-基}丙-2-烯酸甲酯98的合成
[0188]
在0℃，将三甲基膦酰基乙酸酯(14.0ml，86.4mmol)和licl(3.66g，86.4mmol)添加到无水四氢呋喃(250ml)中，并且将所得到的溶液搅拌持续15min，随后添加化合物97(15.0g，72mmol)。向该溶液中缓慢添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(12.9ml，86.4mmol)，并且将所得到的浆料在室温搅拌持续16h。将其倒入碎冰中并且用乙酸乙酯提取。将有机物用h2o和盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制棕色油状物(21g)。这通过sio2色谱法(9:1环己烷/乙酸乙酯)纯化，以给出作为浅黄色固体的化合物98(17.23g，91％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ0.24(s,9h),3.78(s,3h),6.19(d,j＝15.7hz,1h),7.05
–
7.14(m,2h),7.67(d,j＝15.7hz,1h)；
13
c nmr(75mhz,cdcl3)δ-0.3,51.7,97.0,101.9,117.3,125.8,130.6,133.3,136.5,140.4,166.9；ir(atr)v
max
/cm
–
1 2953w,2899w,2144m,1715s,1621s,1516w,1432m,1391w,1301s,1269s,1202s,1161s,838s；ms(es)：m/z＝265.1[m+h]
+
；hrms(es)对于c
13h17
o2ssi[m+h]
+
的计算值：265.0713，实测值：265.0713。
[0189]
实施例5.4：
[0190]
2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基(2e)-3-(5-乙炔基噻吩-2-基)丙-2-烯酸酯99的合成
[0191]
将化合物98(13.03g，49.3mmol)溶解在三乙二醇单甲醚(50ml)中，随后添加20％w/v naoh水溶液(1.3ml)。将所得到的混合物在室温搅拌持续16h，随后将溶液用乙酸乙酯稀释。将有机物用h2o和盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制深色油状物(16g)。这通过sio2色谱法(1:1环己烷/乙酸乙酯)纯化，以给出作为快速变暗的黄色油状物的化合物99(8.18g，51％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ3.36(s,3h),3.46(s,1h),3.50
–
3.56(m,2h),3.61
–
3.69(m,6h),3.72
–
3.79(m,2h),4.26
–
4.38(m,2h),6.24(d,j＝15.7hz,1h),7.09(d,j＝3.8hz,1h),7.17(d,j＝3.8hz,1h),7.68(dd,j＝15.7,0.6hz,1h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ59.0,63.8,69.1,70.5,70.6,71.9,83.7,117.7,124.6,130.5,133.8,136.5,140.8,166.3；ir(atr)v
max
/cm
–13241br,3089w,2874br,2098w,1705s,1622s,1516m,1445m,1342m,1301m,1264s,1165s,1100s,807s；ms(es)：m/z＝325.1[m+h]
+
；hrms(es)对于c
16h21
o5s[m+h]
+
的计算值：325.1104，实测值：325.1100。
[0192]
实施例6：光活化的化合物100的合成
[0193]
光活化的化合物100的合成在图7中示出，并且在下文详述。
[0194]
2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基(2e)-3-[5-(2-{4-[(5-氨基戊基)(甲基)氨基]苯基}乙炔基)噻吩-2-基]丙-2-烯酸酯100的合成
[0195]
将化合物96(1.70g，5.34mmol)和化合物99(2.42g，7.48mmol)溶解在三乙胺(80ml)中，并且溶液通过用氩气鼓泡持续1h来脱气。然后在氩气下添加pd(pph3)2cl2(372mg，0.53mmol)和cui(100mg，0.53mmol)，并且将所得到的悬浮液在60℃搅拌持续72h。将所得到的悬浮液用二氯甲烷稀释，并且用饱和的nahco3和水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以
给出粗制深色油状物(3.75g)。这通过sio2色谱法(95:5二氯甲烷/甲醇，1％三乙胺)纯化，以给出作为浅橙色固体的化合物100(0.47g，17％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.32
–
1.41(m,2h),1.54
–
1.64(m,4h),2.81(t,j＝7.2hz,2h),2.95(s,3h),3.30
–
3.35(m,2h),3.37(s,3h),3.53
–
3.56(m,2h),3.64
–
3.69(m,6h),3.75
–
3.79(m,2h),4.29
–
4.39(m,2h),6.20(d,j＝15.7hz,1h),6.56
–
6.65(m,2h),7.07
–
7.14(m,2h),7.31
–
7.40(m,2h),7.70(dd,j＝15.7,0.6hz,1h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ24.2,26.5,31.0,38.3,41.1,52.2,59.0,63.7,69.2,70.6,70.6,71.9,80.6,97.7,108.3,111.4,116.4,127.6,131.3,131.5,132.8,137.0,139.4,149.2,166.7；ir(atr)v
max
/cm
–
1 2925m,2871m,2189w,1738m,1712m,1604s,1530s,1511m,1376m,1196m；ms(asap)：m/z＝515.2[m+h]
+
；hrms(asap)对于c
28h39
n2o5s[m+h]
+
的计算值：515.2574，实测值：515.2569。
[0196]
实施例7：被保护的hdac抑制剂101的合成
[0197]
具有光活化的细胞杀伤活性的被保护的hdac抑制剂化合物101的合成在图8中示出，并且在下文详述：
[0198]
2-[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙基(2e)-3-[5-(2-{4-[(5-{7-[(乙酰氧基)氨基甲酰基]庚酰氨基}戊基)(甲基)氨基]苯基}乙炔基)噻吩-2-基]丙-2-烯酸酯101的合成
[0199]
将化合物100(128mg，0.25mmol)溶解在二氯甲烷(10ml)中，并且将溶液冷却至0℃，随后添加4-甲基吗啉(0.055ml，0.5mmol)、化合物88(76mg，0.33mmol)和丙基膦酸酐(在乙酸乙酯中的50％wt.，0.32ml，0.5mmol)，并且将所得到的混合物在室温搅拌持续16h。将混合物用二氯甲烷稀释，用h2o洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制黄色油状物。这通过sio2色谱法(95:5，二氯甲烷/甲醇)纯化，以给出作为黄色油状物的化合物101(141mg，7％)：1h nmr(400mhz,cdcl3)δ1.30
–
1.42(m,6h),1.46
–
1.55(m,2h),1.55
–
1.63(m,4h),1.64
–
1.72(m,2h),2.11
–
2.17(m,2h),2.20(s,3h),2.23(t,j＝7.3hz,2h),2.95(s,3h),3.17
–
3.26(m,2h),3.33(t,j＝7.3hz,2h),3.37(s,3h),3.51
–
3.57(m,2h),3.63
–
3.70(m,6h),3.71
–
3.80(m,2h),4.26
–
4.40(m,2h),5.64(s,1h),6.20(d,j＝15.6hz,1h),6.61(d,j＝5.4hz,2h),7.09(d,j＝3.8hz,1h),7.11(d,j＝3.9hz,1h),7.31
–
7.41(m,2h),7.70(dd,j＝15.7,0.6hz,1h),9.55(s,1h)；
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ18.3,24.3,24.7,25.3,26.5,26.9,28.0,28.2,29.5,32.5,36.2,38.3,39.3,52.2,53.4,59.0,63.7,69.2,70.5,70.6,70.6,71.9,77.0,80.7,97.6,111.4,116.4,127.5,131.3,131.5,132.8,137.0,139.4,148.2,166.7,168.8,173.3；ir(atr)v
max
/cm
–
1 3304br,2927m,2860m,2189m,1708m,1645m,1619s,1603s,1529s,1512m,1367m,1242m,1193s,1137s,1110m,852m；ms(es)：m/z＝728.3[m+h]
+
；hrms(es)对于c
38h54
n3o9s[m+h]
+
的计算值：728.3575，实测值：728.3578。
[0200]
实施例8：荧光素二乙酸酯细胞生存力测定
[0201]
如下进行荧光素二乙酸酯细胞生存力测定，该测定测量响应于在没有辐照(无光)的情况下和在辐照(光)时用化合物92处理，hacat角质形成细胞的生存力：
[0202]
将hacat角质形成细胞接种在两个96孔板中，并且在37℃、5％ co2孵育持续24h。在将细胞在37℃、5％ co2孵育持续一小时之前，移除孵育培养基并且添加一系列浓度的化合物92以及二甲基亚砜(dmso)对照，随后将一个板在405nm处辐照持续5min(72mw/cm2)。然后将两个板在37℃、5％ co2孵育持续24h。移除培养基，并且将细胞用1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤，然后添加荧光素二乙酸酯(fda)，并且将细胞在室温在黑暗中孵育持续10min。
然后去除荧光素二乙酸酯染色剂，并且将细胞用1x磷酸盐缓冲盐水洗涤。在485nm/520nm处读取板，以确定在具有和不具有光暴露的情况下在不同处理浓度的化合物92的细胞生存力。结果在图9中示出，并且展示光活化在低浓度(ic
50
＝0.69μm)引起细胞死亡。由于响应于酶促代谢的hdac抑制活性，细胞生存力在较高的浓度(ic
50
＝5.50μm)在没有光活化的情况下降低。
[0203]
实施例9：免疫荧光成像
[0204]
如下进行用化合物92(5μm)和乙醇(etoh)处理并且用检测乙酰化的h3组蛋白的存在的抗乙酰基-h3一级抗体共处理的hacat角质形成细胞的免疫荧光成像：
[0205]
将50,000个hacat细胞铺板在盖玻片上并生长持续2天，然后添加化合物92(5μm)并在室温孵育持续30min。将细胞在磷酸盐缓冲盐水中洗涤，然后在4％ pfa中固定。将细胞再次用磷酸盐缓冲盐水洗涤，然后封闭并用在磷酸盐缓冲盐水中的0.3％triton 100-x/5％山羊血清透化持续60min。然后将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并且添加抗乙酰基组蛋白3抗体并在4℃孵育过夜。添加二级抗体(alexa-594抗兔)持续45min，然后将细胞再次洗涤并安装用于成像。
[0206]
结果在图10中示出。由此可以看出，化合物92在十分钟之后呈现出有限的活性，但是在一小时之后，细胞呈现出特征性核环表型，其指示乙酰化的h3响应于hdac酶的抑制而积聚。当化合物92被酶促代谢为活性形式时，这种延迟的行为指示初始滞后阶段。乙醇处理的细胞在任一时间点都没有呈现出这种核环表型。
[0207]
实施例10：经处理的scc-4细胞中的乙酰基-h3丰度
[0208]
为了测量scc-4细胞中的乙酰基-h3蛋白丰度，将细胞以350,000个细胞/孔接种在6孔板中。接下来的一天，将细胞用化合物或对照处理。在处理15分钟和/或1小时之后，将细胞在ripa缓冲液中裂解。使用任何kd
tm
tgx
tm
预制蛋白凝胶在细胞裂解物上进行sds-page以分离蛋白质。随后将蛋白质转移到pvdf膜(macherey-nagel)上，然后在包含5％乳和2.5％鱼皮明胶的tbst中封闭。将一级抗体(乙酰基-h3，9677s，cst和α-微管蛋白，t5168，sigma)和二级抗体(山羊抗兔igg，a6154，sigma和山羊抗小鼠，sa00001-1，proteintech)在封闭缓冲液中稀释，并在室温各染色持续1小时，在步骤之间进行tbst洗涤。使用ibright成像仪(invitrogen)测量化学发光信号。对乙酰基-h3水平进行归一化，并且所得到的密度测定测量值(使用imagej软件测量)在图11至图13中示出。使用imagej软件进行图像分析。
[0209]
图11示出了在用培养基、dmso(二甲基亚砜)、saha(辛二酰苯胺异羟肟酸)、化合物27和化合物93处理15分钟和1小时之后乙酰基-h3的密度测定测量值。将乙酰基-h3水平针对α-微管蛋白(15分钟)和ac-40(1小时)进行归一化。
[0210]
图12示出了在用培养基、dmso(二甲基亚砜)、saha(辛二酰苯胺异羟肟酸)、化合物27、化合物93和化合物101处理1小时之后乙酰基-h3的密度测定测量值。将乙酰基-h3水平针对α-微管蛋白进行归一化。
[0211]
图13示出了在用培养基、dmso(二甲基亚砜)、saha(辛二酰苯胺异羟肟酸)、化合物27和化合物92处理15分钟之后乙酰基-h3的密度测定测量值。将乙酰基-h3水平针对α-微管蛋白进行归一化。
[0212]
实施例11：胱天蛋白酶-3在经处理的hacat细胞中的表达
[0213]
将hacat细胞以每孔50,000个细胞接种在6孔板中的盖玻片上。接下来的一天，将细胞用50nm和100nm的化合物93处理持续30分钟。dmso被用作对照。通过使用photoreact 365辐照来进行光活化，photoreact 365被改良以在5分钟内以29mw/cm2发射405nm的光。接下来的一天，细胞然后使用4％ pfa固定，使用triton x-100/吐温20透化，在封闭缓冲液(在pbs中的5％ bsa和0.1％吐温20)中封闭。将一级抗体(胱天蛋白酶-3、ab13847、abcam)和二级抗体(山羊抗兔igg alexa fluor 594)在包含5％山羊血清和0.1％吐温20的pbs中稀释。将盖玻片添加到载玻片中，并且在zeiss lscm 880上成像。使用imagej软件进行图像分析。图14示出了在用dmso、50nm的化合物93和100nm的化合物93处理的hacat细胞中的胱天蛋白酶-3表达以及表达水平的定量。
[0214]
实施例12：化合物在scc-4细胞中的共定位
[0215]
将scc-4细胞以50,000个细胞/孔接种在8孔室载玻片上。接下来的一天，将细胞用1μm的化合物101和1μm的化合物93处理持续1小时。将细胞更换到活细胞成像溶液培养基。在成像之前30分钟将共染色剂(mitotracker、bodipy er tracker、lipidspot 610或lysotracker)添加到细胞中。使用zeiss lscm 880进行成像，并且在imagej上进行图像分析。
[0216]
图15示出了化合物101与scc-4细胞的线粒体(mitotracker)、脂质滴(lipidspot610)和酸性细胞器(lysotracker)的共定位。计算皮尔逊系数以证明化合物定位和共染色剂定位之间的相关性，并且结果在表1中示出。
[0217][0218][0219]
表1：化合物定位和共染色剂定位之间的相关性。
[0220]
图16示出了化合物93与scc-4细胞的线粒体(mitotracker)、内质网(bodipy er tracker)、脂质滴(lipidspot610)和酸性细胞器(lysotracker)的共定位。计算皮尔逊系数以证明化合物定位和共染色剂定位之间的相关性，并且结果在表2中示出。
[0221]
[0222]
表2：化合物定位和共染色剂定位之间的相关性。
[0223]
实施例13：化合物93的脱保护
[0224]
化合物93的脱保护以产生(2e)-3-{5-[2-(4-{4-[7-(羟基氨基甲酰基)庚酰基]哌嗪-1-基}苯基)乙炔基]噻吩-2-基}丙-2-烯酸叔丁酯103在图17中示出，并且在下文详述。
[0225]
将化合物93(500mg，0.82mmol)溶解在甲醇(30ml)中，随后添加naoh(32mg，0.82mmol，作为在h2o中的溶液，1ml)，并且将所得到的溶液在室温搅拌持续5h。将混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机物用h2o洗涤、干燥(mgso4)并蒸发，以给出粗制黄色固体。这通过从乙腈中重结晶来纯化，以给出作为黄色固体的化合物103(170mg，36％)：1h nmr(700mhz,二甲基亚砜-d6)δ1.22
–
1.29(m,4h),1.47(s,9h),1.47
–
1.52(m,4h),1.94(t,j＝7.4hz,2h),2.32(t,j＝7.5hz,2h),3.20
–
3.25(m,2h),3.25
–
3.29(m,2h),3.55
–
3.60(m,4h),6.18(d,j＝15.7hz,1h),6.91
–
7.00(m,2h),7.31(d,j＝3.8hz,1h),7.37
–
7.44(m,2h),7.48(d,j＝3.8hz,1h),7.66(d,j＝15.8hz,1h),8.64(s,1h),10.32(s,1h)；
13
c nmr(176mhz,二甲基亚砜-d6)δ24.6,25.0,27.8,28.4,28.5,32.1,32.2,40.5,44.4,46.8,47.2,80.1,80.9,96.6,110.2,114.7,118.9,125.3,132.1,132.4,132.7,135.5,139.6,150.7,165.0,169.1,170.7；ir(atr)v
max
/cm-1 3207br,2977w,2930w,2858w,2194w,1698m,1619s,1603s,1526m,1508m,1231s,1145s,754m；ms(asap)m/z＝566.2[m+h]
+
；hrms(asap)对于c
31h40
n3o5s[m+h]
+
的计算值：566.2683，实测值：566.2683。
[0226]
在本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或工艺的所有步骤可以以任何组合被组合，除了这样的特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合之外。除非另外明确陈述，否则本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)中所公开的每个特征可以被用作相同、等效或类似目的的可选择的特征替换。因此，除非另外明确陈述，否则所公开的每个特征仅为一系列通用等效特征或类似特征的一个实例。本发明不限于前述实施方案的细节。本发明扩展至在本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)中公开的特征中的任何新颖的特征或特征的任何新颖的组合，或者扩展至如此公开的任何方法或工艺的步骤中的任何新颖的步骤或步骤的任何新颖的组合。