CART细胞疗法和IFNγ的制作方法

本公开涉及嵌合抗原受体(car)工程化免疫细胞、配制方法和使用方法。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤(gbm)是最致命的癌症之一，治疗选项非常有限(1,2,3)。尽管采取了积极的标准治疗疗法，肿瘤复发几乎是不可避免的，而且都是致命的，大多数患者在诊断后不会存活超过两年。免疫疗法的进步激发了人们开发治疗策略以在gbm中引发抗肿瘤免疫应答的努力，这包括嵌合抗原受体(car)t细胞的过继转移。评价gbm中cart细胞的临床研究已证明在选择的患者中的安全性和生物活性的早期证据；尽管如此，应答还是有限的。对于实体瘤诸如gbm的富有成效的car t细胞疗法的挑战是多因素的。肿瘤异质性和细胞可塑性允许抗原丢失肿瘤变体的长出，这导致治疗失败。gbm肿瘤的肿瘤微环境富含髓样，并缺乏t细胞群，这也对car t细胞提出了特定的挑战。

2、尽管肿瘤细胞对il13rα2的表达不均匀，但il13rα2-car t疗法在治疗gbm上已显示出一定的前景(4)。该应答与cns炎性细胞因子的增加和内源性免疫细胞的浸润相关联(4)。与这一观察结果一致，最近对her2-car t细胞疗法后的免疫监测的纵向分析显示了内源性免疫反应的证据，这可能有助于患者的良好的应答(5)。

3、由car t细胞分泌的促炎细胞因子，诸如ifnγ，可能在gbm tme中的免疫浸润的活化和编程中发挥重要作用。ifnγ可以活化巨噬细胞(6)和小胶质细胞(7)、招募和或活化细胞毒性t细胞、将cd4+t细胞极化成th1效应细胞并损害肿瘤促进性treg发育和功能(8，9，10)。额外地，ifn可以作为关键信号(30)以促进肿瘤反应性t细胞的活化和引发(11)。

技术实现思路

1、本文描述了免疫系统细胞，例如t细胞或nk细胞，其表达靶向肿瘤抗原的car和由核酸分子(“重组人ifnγ”)编码的人ifnγ两者，例如携带编码car和人ifnγ两者的核酸分子的免疫细胞。不受任何理论的束缚，共表达似乎增加了免疫细胞的活化、免疫细胞的增殖和识别肿瘤细胞的内源性细胞对肿瘤细胞的杀伤中的一个或多个。car可以包含靶向性域，该靶向性域是靶向至肿瘤抗原的scfv(例如靶向至cd19的scfv)或结合肿瘤细胞上的受体的配体(例如il-13或其变体)。因此，该细胞可以携带编码car和人ifnγ的核酸分子。car和人ifnγ的表达可以受相同表达控制序列的控制，也可以受不同表达控制序列的控制。这些细胞可以携带编码包含car和人干扰素γ的单个氨基酸序列的核酸分子。例如，car的氨基酸序列后面可以是核糖体跳读序列，然后是包含人ifnγ的氨基酸序列。氨基酸序列可以包含至少一种用于蛋白质分泌的信号序列(例如，用于car分泌的信号序列和用于人ifnγ表达的信号序列)。在一些实施方案中，本公开的核酸可以是非内源性核酸。

2、表达car和干扰素的免疫细胞可以靶向并杀伤表达car靶标的癌细胞。此外，它们还可以通过例如活化肿瘤微环境中的先天性和适应性免疫亚群来激活对不表达car靶标的癌细胞的杀伤。以这种方式，它们可用于治疗包含表达car靶标的癌细胞和不表达car靶标或具有非常低的car靶标表达的癌细胞的肿瘤。

3、人ifnγ可以包含以下氨基酸序列：

4、qdpyvkeaenlkkyfnaghsdvadngtlflgilknwkeesdrkimq sqivsfyfklfknfkddqsiqksvetikedmnvkffnsnkkkrddfekltn ysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktgkrkrsqmlfrgrrasq(seq id no:1)

5、人ifnγ氨基酸序列之前可以有指导人干扰素γ从真核细胞例如人细胞分泌的信号序列。因此，可以使用人干扰素γ前体(信号序列下划线)：

6、qdpyvkeaenlkkyfnaghsdvadngtlflgilknwkeesdrkimqsqivsfyfklfknfkddqsiqksvetikedmnvkffnsnkkkrddfekltnysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktgkrkrsqmlfrgrrasq(seq id no:b)

7、car可以靶向至肿瘤抗原，但不限于包含以下的实例：

8、适合的il-13car包含人il-13的变体，人il-13包含以下氨基酸序列：

9、gpgpvppstalrylieelvnitqnqkaplcngsmvwsinltagmycaa leslinvsgcsaiektqrmlsgfcphkvsagqfsslhvrdtkievaqfvkd llllhlkklfregrfn(seq id no:c)

10、野生型人il13的序列(信号序列下划线)：

11、ltclggfaspgpvppstalreliee lvnitqnqkaplcngsmvwsinltagmycaaleslinvsgcsaiektqrm lsgfcphkvsagqfsslhvrdtkievaqfvkdlllhlkklfregrfn(seq id no:d)

12、il-13car可以包含变体il13，例如，变体il13包含seq id no:c；间隔物(例如，包含seq id no:2-12中任一个)；跨膜域(例如，包含seq id no:13-20中任一个)；共刺激域(包含意seq id no:22-25中任一个)；任选地，3-15个氨基酸的接头(例如，ggg)；和cd3ζ胞质域(seq id no:21或其包含seq id no:50-56中任一个的变体)。有用的car可以包含seqid no:70-76中任一个。

13、gpvppstalrylieelvnitqnqkaplcngsmvwsinltagmycaaleslinvsgcsaiektqrmlsgfcphkvsagqfsslhvrdtkievaqfvkdlllhlkklfregrfneskygppcppcpapefeggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgkmalivlggvaglllfiglgiffkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelgggrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr

14、seq id no:76

15、本文描述了包含编码嵌合抗原受体(car)的核苷酸序列的核酸分子，其中嵌合抗原受体包含：包含seq id no:c的氨基酸序列的靶向性域；间隔物、跨膜域；共刺激域；和cd3ζ信号传导域。在各种实施方案中：跨膜域选自：cd4跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；其中il13受体靶向性域包含具有至多3个单个氨基酸取代(在某些情况下，位置13处的y未被取代)的seq id no:c氨基酸序列，或由其组成；共刺激域选自：41bb共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体、cd28共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；cd28gg共刺激域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，其中该共刺激域是41bb共刺激域；41bb共刺激域包含seq id no:24或其具有1-5个氨基酸修饰的变体的氨基酸序列；cd3ζ信号传导域包含seq id no:21的氨基酸序列或其包含seq id no:50-56中任一个的变体；3至15个氨基酸的接头位于4-1bb共刺激域和cd3ζ信号传导域或其变体之间；car包含seq id no:70-76的氨基酸序列或其具有1-5个氨基酸修饰的变体；car包含与seq id no:70-76中任一个至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列或由与seq idno:70-76中任一个至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列组成；car包含与seq id no:70-76中的任一个相比具有不超过5、4、3、2或1个单个氨基酸取代和/或缺失的氨基酸序列。还描述了包含前述核酸分子中任一个的表达载体。还描述了包含前述核酸分子中任一个的病毒载体。

16、car可以包含靶向至任何癌细胞抗原例如cd19、muc16、mucl、tmuc1、caix、cea、cd20、cd22、cd30、her-2、magea3、p53、psca、bcma、cd123、cd44v6、整合素b7、icam-1、cd70、cea、gd2、psma、b7h3、cd33、flt3、cll1、叶酸受体、egfr、cd7、egfrviii、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、cd5、ror1、cs1、afp、cd133、和tag-72的scfv。car可以包含配体，例如il-13或其变体、氯毒素或其变体等。

17、因此，用于共表达的有用car包括以下中描述的那些：wo 2016/044811、wo 2017/079694、wo 2017/066481和wo 2017/062628。

18、还描述了含有前述核酸分子中任一种的人t细胞群、nk细胞群、髓样细胞群、γδt细胞群或ipsc衍生的效应细胞群。还描述了含有前述表达载体或病毒载体中任一种的人t细胞群。在各种实施方案中，人t细胞群包含中央记忆t细胞、初始记忆t细胞、泛t细胞或基本上消减cd25+细胞和cd14+细胞的pbmc。

19、还描述了治疗患有癌症(例如，脑癌(胶质母细胞瘤)、胰腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肝癌、肉瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、输卵管癌、甲状腺癌、膀胱癌、宫颈癌、消化系统癌、头颈癌、骨肉瘤、肾细胞癌、前列腺癌、乳腺癌或肺癌)的患者的方法，其包括施用携带本文所述核酸的自体或同种异体人t细胞群。在各种实施方案中，局部或全身施用细胞；并通过单次给药或重复给药来施用细胞。

20、本文还描述了制备car t细胞的方法，其包含：提供自体或同种异体人t细胞群，并通过包含本文所述的核酸分子的载体转导t细胞。

21、还描述了携带表达car和ifnγ的载体或核酸的t细胞。在各种实施方案中：至少20％、30％或40％的转导的人t细胞是中央记忆t细胞；至少30％的转导人t细胞是cd4+和cd62l+或cd8+和cd62l+。在各种实施方案中：人t细胞群包含表达嵌合抗原受体的载体，该嵌合抗原受体包含选自seq id no:c或70-76或其具有1-5个(例如1或2个)氨基酸修饰(例如取代)的变体；t细胞群可以包含效应t细胞、效应记忆细胞、中枢记忆t细胞、干中枢记忆细胞和初始t细胞中的一种或多种；人t细胞群包含中央记忆t细胞(tcm细胞)，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的细胞是t cm细胞，或t细胞群包含中央记忆t细胞、初始t细胞和干中央记忆细胞(tcm/scm/n细胞)的组合，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的细胞是tcm/scm/n细胞。在一些实施方案中，t细胞群包含效应t细胞和效应记忆细胞。在一些实施方案中，t细胞群包含cd4+细胞和cd8+细胞两者(例如，至少20％的cd3+ t细胞是cd4+并且至少3％的cd3+ t细胞是cd8+并且至少70％、80％或90％的cd3+ t细胞是cd4+或cd8+；至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％的细胞cd3+细胞是cd4+，并且至少4％、5％、8％、10％、20％的cd3+细胞是cd8+细胞)。在一些实施方案中，人t细胞群对患者是自体的。在一些实施方案中，人t细胞群对患者是同种异体的。在一些实施方案中，表达car和ifnγ的t细胞在全文中可互换称为，尤其是il13rα2-ifnγcar t细胞、il13rα2-car/ifnγt细胞和il13 car t-ifnγ细胞。

22、在各种实施方案中：间隔物域选自由以下组成的组：igg4(eq)间隔物域、igg4(hl-ch3)间隔物域和igg4(ch3)间隔物域；间隔物域包含seq id no:10；间隔物域包含seq idno:9；间隔物域包含seq id no:12；跨膜域选自由以下组成的组：cd4跨膜域、cd8跨膜域和cd28跨膜域；共刺激域选自cd28共刺激域、cd28gg共刺激域以及41-bb共刺激域。

23、还公开了包含编码嵌合抗原受体(car)的核苷酸序列的核酸分子，其中嵌合抗原受体包含：靶向性域，其包含含有变体il13域的氨基酸序列，该变体il13域包含seq id no:c的109、110、111、112、113个连续氨基酸或具有1、2、3、4或5个单个氨基酸变化的整个seqid no:c；间隔物域；跨膜域；共刺激域和cd3ζ信号传导域。

24、在各种实施例中：间隔物域包含seq id no:2-12中任一个的氨基酸序列；共刺激域包含seq id no:22-25中任一个的氨基酸序列；和cd3ζ域或其变体。在一些情况下，car包含cd28共刺激域和变体cd3ζ域。

25、还公开了：包含本文所述核酸分子的载体或表达载体；携带本文所述核酸分子的人t细胞群或nk细胞群。在各种实施方案中：人t细胞群包含中央记忆t细胞、初始记忆t细胞、泛t细胞或基本上消减cd25+细胞和cd14+细胞的pbmc。

26、还描述了治疗患有胶质母细胞瘤、胰腺导管腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、乳腺癌或肺癌的患者的方法，其包括施用携带本文所述核酸分子的自体或同种异体细胞群。在各种实施方案中：局部施用或全身施用或心室内施用细胞；通过单次给药或重复给药。

27、还描述了制备car t细胞的方法，其包含：提供自体或同种异体人t细胞群或nk，并用包含本文所述的核酸分子的载体转导该细胞。

28、还描述了由本文描述的核酸编码的多肽。

29、在各种实施方案中，nk细胞衍生自脐带血、外周血或干细胞。

30、car或多肽可以与可用于监测表达的额外序列，例如，t2a或p2a跳读序列和截短的egfr或截短的cd19或lngfr(可以由seq id no:31的氨基酸序列组成或包含seq id no:31的氨基酸序列)一起表达。

31、非内源性或外源性核酸分子(或多肽)是非内源性存在于细胞中的核酸分子(或多肽)。该术语包括在细胞中表达的重组核酸分子(或多肽)。外源性核酸是天然野生型细胞中不存在的核酸；例如，外源性核酸可以在序列、位置/定位上与内源性对应物不同。可以通过基因工程将外源性核酸分子引入细胞中，或者引入到该细胞中或者引入到细胞的祖细胞中。编码多肽的外源性核酸分子可以连接至表达控制序列并且可以包含编码信号序列的序列，其中之一或两者可以与编码多肽的序列异源。

32、间隔物区

33、本文所述的car或多肽可以包含位于靶向性域(即il13或其变体)和跨膜域之间的间隔物。可以使用多种不同的间隔物。其中一些包含人fc区的至少一部分，例如人fc区的铰链部分或ch3域或其变体。下表1提供了可用于本文所述的car中的各种间隔物。

34、表1：间隔物的实例

35、

36、

37、一些间隔物区包含全部或部分的免疫球蛋白(例如，iggl、igg2、igg3、igg4)铰链区，即位于免疫球蛋白的ch1域和ch2域之间的序列，例如igg4fc铰链或cd8铰链。一些间隔物区包含免疫球蛋白ch3域(称为ch3或δch2)或ch3域和ch2域两者。免疫球蛋白衍生的序列可以包含一个或多个氨基酸修饰，例如1、2、3、4或5个取代，例如减少脱靶结合的取代。

38、间隔物区还可以包含具有序列eskygppcpscp(seq id no:4)或eskygppcppcp(seqid no:3)的igg4铰链区。间隔物区还可以包含铰链序列eskygppcppcp(seq id no:3)，随后是接头序列gggssgggsg(seq id no:2)，随后是igg4 ch3序列gqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpenn ykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk seq id no:12)。因此，整个间隔物区可以包含以下序列：eskygppcppcpgggssgggsggqprepqvytlppsqeemtknqvsltclv kgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seq id no:11)。

39、跨膜域

40、多种跨膜域可以用于car。在一些情况下，跨膜域是cd28跨膜域，其包括与以下至少90％、至少95％、至少98％相同或与以下相同的序列：fwvlvvvggvlacysllvtvafiifwv(seq id no:14)。在一些情况下，与seq id no:14相比，cd28跨膜域具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。表2包含适合的跨膜域的实例。当存在间隔物区时，跨膜域(tm)位于间隔物区的羧基末端。

41、表2：跨膜域的实例

42、

43、共刺激域

44、共刺激域可以是任何适合与cd3ζ信号传导域使用的域。在一些情况下，共信号传导域是cd28共信号传导域，其包括与以下至少90％、至少95％、至少98％相同或与以下相同的序列：rskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrs(seq id no:22)。在一些情况下，与seq id no:22相比，4-1bb共信号传导域具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。

45、共刺激域位于跨膜域和cd3ζ信号传导域之间。表3包含适合的共刺激域的实例以及cd3ζ信号传导域的序列。

46、表3：cd3ζ域和共刺激域的实例

47、

48、

49、

50、在各种实施方案中：共刺激域选自由以下组成的组：表3中描绘的共刺激域或其具有1-5个(例如，1个或2个)氨基酸修饰的变体、cd28共刺激域或其具有1-5个(例如，1个或2个)氨基酸修饰的变体、4-1bb共刺激域或其具有1-5个(例如，1个或2个)氨基酸修饰的变体和ox40共刺激域或其具有1-5个(例如，1个或2个)氨基酸修饰的变体。在某些实施方案中，存在4-1bb共刺激域或其具有1-5个(例如，1个或2个)氨基酸修饰的变体。在一些实施方案中，由两个共刺激域，例如cd28共刺激域或其具有1-5个(例如，1个或2个)氨基酸修饰(例如，取代)的变体和4-1bb共刺激域或其具有1-5个(例如1个或2个)氨基酸修饰(例如取代)的变体。在各种实施方案中，1-5个(例如1个或2个)氨基酸修饰是取代。共刺激域是cd3ζ信号传导域的氨基末端，并且由2-10个例如3个氨基酸(例如ggg)组成的短接头可以位于共刺激域和cd3ζ信号传导域之间。

51、cd3ζ信号传导域

52、cd3ζ信号传导域可以是任何适合与cd3ζ信号传导域使用的域。在一些情况下，cd3ζ信号传导域包括与以下至少90％、至少95％、至少98％相同或与以下相同的序列：rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seq id no:21)。在一些情况下，与seq id no:21相比，cd3ζ信号传导域具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。在一些情况下，cd3ζ信号传导域包含seq id no:50-56中的任一个。这些变体cd3ζ信号传导域在一个或多个itam域中具有y至f突变。在一些情况下，优选使用具有使itam 2和3失活的突变的变体。

53、人ifnγ

54、ifnγ域是至少包含成熟人ifnγ的功能部分(例如，氨基酸24-161人ifnγ；genbank np_000610)的域或是成熟人ifnγ的功能部分。

55、成熟的人ifnγ具有序列：qdpyvke aenlkkyfna ghsdvadngtlflgilknwkeesdrkimqs qivsfyfklf knfkddqsiq ksvetikedm nvkffnsnkkkrddfekltnysvtdlnvqr kaiheliqvm aelspaaktg krkrsqmlfr grrasq(成熟ifnγ；seq idno:1)。未成熟的人ifnγ(包含信号序列)具有序列：mkytsyilaf qlcivlgslg cycqdpyvkeaenlkkyfnaghsdvadngt lflgilknwk eesdrkimqs qivsfyfklf knfkddqsiq ksvetikedmnvkffnsnkk krddfekltn ysvtdlnvqr kaiheliqvm aelspaaktg krkrsqmlfr grrasq(seqid no:b)。在一些实施方案中，人ifnγ包含序列：qdpyvkeaenlkkyfnaghsdvadngtlflgilknwkeesdrkimqsqivsfyfklfknfkddqsiqksvetikedmnvkffnsnkkkrddfekltnysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktgkrkrsq(seq id no:z)。

56、在一些情况下，与seq id no:1或seq id no:b或seq id no:z相比，ifnγ域具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。例如，可以在seq id no:1或seq id no:z中进行以下氨基酸变化中的1、2或所有3个：k74a、e75y和n83r。在一些实施方案中，本文提供的ifnγ域包含与seq id no:1或seq id no:b或seq id no:z具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ifnγ在对应于选自seq id no:1或seq id no:z的q1、d2、p3、k6、q64、q67、k68、e71、t72、k74、e75、d76、n78、v79、k80、n83、s84、k86、r89、d90或其任何组合的氨基酸残基的位置处包含至少一个氨基酸取代。

57、在一些实施方案中，本文提供的ifnγ包含与seq id no:1或seq id no:z具有至少95％的氨基酸序列，并进一步包含在对应于选自seq id no:1或seq id no:z的q1、d2、p3、k6、q64、q67、k68、e71、t72、k74、e75、d76、n78、v79、k80、n83、s84、k86、r89、d90或其任何组合的氨基酸残基的位置处包含至少一个氨基酸取代。

58、在一些实施方案中，还可以使用ifnγ的变体。许多ifnγ变体是本领域已知的并且可以是有用的(mendoza jl,et.al.,(2019)nature 567:56；wo 2020/028275)。

59、截短的egfr或截短的cd19或lngfr

60、在一些实施方案中，本文所述的car或肽可以包含核糖体跳读序列(例如，legggegrgslltcgdveenpgpr；seq id no:27)并具有与以下至少90％、至少95％、至少98％相同或与以下相同的序列的截短的egfr：lvtslllcelphpaflliprkvcngigigefkdslsinatnikhfknctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhafenleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkklfgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcnllegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvmgenntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvvalgiglfm(seq id no:28)。在一些情况下，与seq id no:28相比，截短的egfr具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。

61、在一些实施方案中，本文所述的car或肽可以包含核糖体跳读序列(例如，legggegrgslltcgdveenpgpr；seq id no:27)并具有与以下至少90％、至少95％、至少98％相同或与以下相同的序列的截短的cd19r(也称cd19t)：mppprllffllfltpmevrpeeplvvkveegdnavlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrplaiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcglknrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppcvpprdslnqslsqdltmapgstlwlscgvppdsvsrgplswthvhpkgpksllslelkddrpardmwvmetglllprataqdagkyychrgnltmsfhleitarpvlwhwllrtggwkvsavtlaylifclcslvgilhlqralvlrrkr(seq id no:26)。在一些情况下，与seq id no:26相比，截短的cd19t具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。

62、在一些实施方案中，本文所述的car或肽可以包含核糖体跳读序列(例如，legggegrgslltcgdveenpgpr；seq id no:27)并具有与以下至少90％、至少95％、至少98％相同或与以下相同的序列的截短的tegfr：mlllvtslllcelphpaflliprkvcngigigefkdslsinatnikhfknctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhafenleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkklfgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcnllegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvmgenntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvvalgiglfm(seq id no:45)。

63、在一些实施方案中，本文所述的car或肽可以包含核糖体跳读序列并具有与以下至少90％、至少95％、至少98％相同或与以下相同的序列的截短的lngfr：mgagatgramdgprlllllllgvslggakeacptglythsgecckacnlgegvaqpcganqtvcepcldsvtfsdvvsatepckpctecvglqsmsapcveaddavcrcaygyyqdettgrceacrvceagsglvfscqdkqntvceecpdgtysdeanhvdpclpctvcedterqlrectrwadaeceeipgrwitrstppegsdstapstqepeappeqdliastvagvvttvmgssqpvvtrgttdnlipvycsilaavvvglvayiafkrwnsckqnk(seq id no:cc)。在一些情况下，与seq idno:cc相比，截短的lngfr具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。

64、可用于本文所述的car或肽的其他核糖体跳读序列包括具有与以下至少95％相同的序列的t2at：egrgslltcgdveenpgp(seq id no:46)或具有与以下至少95％相同的序列的p2a:gsgatnfsllkqagdveenpgp(seq id no:47)。在一些情况下，与seq id no:46或47相比，核糖体跳读序列具有1、2、3、4或5个氨基酸变化(优选保守的)。

65、氨基酸修饰是指蛋白质或肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。“氨基酸取代”或“取代”是指用另一个氨基酸替换亲本肽或蛋白质序列中特定位置处的氨基酸。可以以非保守方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸变化为属于另一组的氨基酸)或以保守方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸组的氨基酸变化为属于同一组的氨基酸)进行取代以改变所得蛋白质中的氨基酸。这种保守的变化通常导致所得蛋白质的结构和功能发生较小的变化。以下是各种氨基酸组的实例：1)具有非极性r基团的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；2)具有不带电荷的极性r基团的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；3)具有带电极性r基团的氨基酸(ph 6.0时带负电)：天冬氨酸、谷氨酸；4)碱性氨基酸(ph 6.0时带正电)：赖氨酸、精氨酸、组氨酸(ph 6.0时)。另一种分组可能是那些具有苯基的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

66、在某些情况下，可以使用载体产生car，其中car开放阅读框后面是核糖体跳读序列和缺少胞质信号传导尾的截短的egfr(egfrt)或截短的cd19r或lngfr。在这种排列中，egfrt的共表达提供了惰性、非免疫原性的表面标志物，其允许精确测量基因修饰的细胞，并能够阳性选择基因修饰的细胞，以及过继转移后体内治疗性nk细胞的高效细胞跟踪。高效控制增殖以避免细胞因子风暴和脱靶毒性是nk细胞免疫疗法成功的重要障碍。并入car慢病毒或逆转录病毒载体中的egfrt、cd19t或lngfr可以作为自杀基因，以在治疗相关的毒性发生时消除car+细胞。

67、在一些情况下，本文所述的核酸分子包含控制car和人干扰素γ两者表达的启动子。在其他情况下，本文所述的核酸分子包含控制car表达的第一启动子和控制人干扰素γ表达的第二启动子。在一些情况下，第一和第二启动子是相同的，并且在一些情况下它们是不同的。在一些实施方案中，第一启动子是强组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，第二启动子是比第一启动子弱的启动子或者是诱导型启动子。有用的启动子是本领域众所周知的。例如，合成的nfat启动子可以用于编码car构建体的核酸中。有用的启动子可以包含cmv、ef1、sv40、pkg1、pkg100、ubc、四环素、多西环素、nfat和任何其他组成型或诱导型启动子中的一种或多种。在一些实施方案中，可以使用nfat识别元件(tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x)。在一些实施方案中，有用的启动子包含nfat识别元件的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或十一个重复。在一些实施方案中，有用的启动子包含seq id no:x、x2、x3、x4、x5、x6、x7、x8、x9、x10和x11中的任何一个或多个。

68、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq idno:x2

69、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x3

70、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x4

71、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x5

72、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x6

73、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x7tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x8

74、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttc

75、atacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggagg

76、aaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacag

77、aaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaa

78、ctgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x9tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x10

79、tggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttc

80、atacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggagg

81、aaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacag

82、aaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaa

83、ctgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggc

84、gtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcg；seq id no:x11

85、本文描述的car或多肽可以通过本领域已知的任何方式产生，但优选地其使用重组dna技术产生。方便的话，编码嵌合受体的几个区的核酸可以通过本领域已知的分子克隆标准技术(基因组文库筛选、重叠pcr、引物辅助连接、定点诱变等)制备并组装成完整的编码序列。优选将所得编码区插入到表达载体中并用于转化适合的表达宿主细胞系，优选免疫细胞(例如t细胞)，最优选自体t细胞。

86、car或多肽可以通过编码car或多肽的mrna在细胞群中瞬时表达。可以通过电穿孔将mrna引入免疫细胞中(wiesinger et al.2019cancers(basel)11:1198)。

87、在一些实施方案中，本文描述了增加患有癌症的受试者的存活的方法，其包括施用包含本文所述的car免疫细胞的组合物。

88、在一些实施方案中，本文描述了治疗患者中的癌症的方法，其包括施用包含本文所述的car免疫细胞的组合物。

89、在一些实施方案中，本文描述了是减轻或改善患者中与癌症相关的症状的方法，其包括施用包含本文描述的car免疫细胞的组合物。

90、在一些实施方案中，局部或全身施用包含本文所述的car nk细胞或cart细胞的组合物。在一些实施方案中，包含本文所述的car免疫细胞的组合物通过单次或重复给药来施用。在一些实施方案中，将包含本文所述的car免疫细胞的组合物施用于患有癌症、病原体感染、自身免疫性病症或正在进行同种异体移植的患者。

91、在一些实施方案中，癌症是实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤。

92、除非另有定义，那么本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；另外，也可以使用本领域已知的其他适合的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的而非旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献，出于任何和所有目的通过引用以其整体并入。

93、从下面的详细描述和附图以及从权利要求中，所描述的组合物和方法的其他特征和优点将是显而易见的。