新型酵母菌株及其在控制植物病原体中的用途的制作方法

新型酵母菌株及其在控制植物病原体中的用途
1.本发明涉及新型酵母菌株及其在控制植物病原体中的用途
。
重要的是，本发明涉及一种用于控制主要植物病原体的新型酵母菌株，其可有效预防
、
治疗和控制多种植物病原体以及影响整个植物
(
地上部分和根部分
)
的相关疾病
。
2.众所周知，农作物会受到各种真菌
、
细菌和病毒性疾病以及许多有害昆虫的影响，这些昆虫也可能是植物病原体的传播媒介
。
3.目前，植物保护主要以化学农药的使用为主
。
然而，由于担心病原体种群中出现对化学活性成分的抗性以及这些化学物质对人类和动物健康以及环境的影响，需要开发替代的植物保护方法，例如植物病害的生物和综合控制
。
害虫综合治理
(ipm)
包括结合使用化学和生物植物保护产品以及有助于控制植物病原体的农艺措施，即不利于病原体侵袭的措施
。
另一方面，生物管理
(
即生物控制
(biological control or biocontrol))
主要依赖于使用由微生物拮抗剂
、
植物源化合物或化学信息素配制而成的产品，这些产品通常是天然存在的，对人类健康和环境构成低风险
。
在过去的几十年中，利用微生物进行植物保护已经产生了许多成熟的商业产品，主要基于土传细菌和真菌，它们主要通过真菌寄生和生产天然化合物
(
例如抗生素或具有抗菌活性的次生代谢物
)
发挥作用
。
使用微生物拮抗剂的目的是扩大对环境影响较小或没有影响的生物防治制剂的范围，这些制剂可以替代或整合那些正在强制执行风险缓解措施以减少其使用
、
甚至从市场上被撤回的化学活性成分
。
4.一些子囊菌和担子菌酵母分离物对于包括作为对抗植物病原体的生物防治剂
(bca)
在内的各种农业施用特别重要
。
附生真菌微生物区系在植物器官的地上部分大量繁殖，适应各种环境应激
。
这些自然特征使酵母和酵母状真菌成为开发用于在田间和储存期间控制植物病原体的植物保护产品的绝佳候选者
。
已选择并表征了几种对不同病原体具有拮抗特性的酵母菌种，作为
bca
用于商业用途，例如：
candida oleophila(ecogen
，兰霍恩，宾夕法尼亚州，美国；
lesaffre-bionext
，法国
)、cryptococcus albidus(lallemand
，蒙特利尔，加拿大
)、candida sake(
西班牙橄榄油研究所
irta
，莱里达，西班牙
)、metschnikowia fructicola(
拜耳，勒沃库森，德国
)
和
aureobasidium pullulans(biofa
，穆辛根，德国
)
，后者是一种酵母状真菌
。
5.对于基于
bca
的产品的商业注册，需要进行生物学
、
生态学和毒理学研究，以证明所选微生物对植物病原体有效且对人类
、
动物和环境无害
。
6.然而，许多生物防治酵母的功效范围无论是在目标病原体还是在培养物方面都太窄
。
事实上，大多数基于微生物的制剂的施用范围大大缩小，因此需要与其他活性成分综合使用
。
此外，生物防治微生物与合成化学活性成分的组合使用对
bca
耐受化学活性成分的有限能力具有重大限制
。
大多数用作
bca
的微生物种类与合成化学品的组合存在许多技术限制，这进一步限制了这些产品的使用
。
7.考虑到这种情况，使用新的生物防治剂以解决上述问题并替代目前市场上的生物防治剂的需求显然是必要的
。
8.在这方面，本发明提供了一种可能的解决方案，因为它提供了一种新型微生物制剂，其可以作为主要植物病原体的生物防治剂
。
9.根据本发明，现已证明酵母菌种
papiliotrema terrestris
及其胞外分泌物质可有利地用于对抗植物病原体
。
10.具体地，申请人现已分离出一种新型酵母菌株
(pt22av)
，其属于担子菌酵母种
papiliotrema terrestris。
上述酵母菌株已根据
《
布达佩斯条约
》
规定的程序于
2020
年
10
月
26
日在荷兰
westerdijk
真菌生物多样性研究所
(cbs)
出于专利申请的目的进行了提交，保藏人爱农创投有限公司
(agroventures srl)
，国际专利申请机构提供的访问号为
cbs147138
以及保藏人提供的鉴定参考
pt22av。
11.根据本发明，表1显示了
papiliotrema terrestris
的
pt22av
菌株的分类学分类
。
12.表
1pt22av
的系统分类
[0013][0014]
papiliotrema
属
(tremellomycete
纲，
tremellales
目，
rhynchogastremataceae
科
)
于
2002
年首次描述，旨在对一种新的微生物种，
papiliotrema bandonii
进行分类
。
最近，涉及许多担子菌酵母菌的物种的分类学重新分类工作已经将许多物种从
cryptococcus
属转移到
papiliotrema
属
。
目前，这个新的真菌属包括大约
24
个物种，其中许多被描述为生物防治剂，如
p.laurentii(
以前称为
c.laurentii)。papiliotrema terrestris
是一个相对较新的物种，实际上它首次在
2015
年被描述
。
[0015]
特别地，如下面报道的实施例所示，根据本发明分离的
papiliotrema terrestris
的
pt22av
菌株与已知的化学和生物产品相比，显示出作为生物防治剂更好或相当的性能
。
特别是，新鲜
、
干燥或脱水的
pt22av
细胞，施用于种子包衣的生物或综合方案中，在苗床
、
田间或收获后阶段，显示出与合成的化学产品相比，疾病发生率有所降低
。
[0016]
如下所示，根据本发明的
papiliotrema terrestris
的
pt22av
菌株在4个欧盟国家对6中作物在田间和收获后针对广泛的生物营养和坏死性真菌病原体进行了为期3年
(2018-2019-2020)
的功效和选择性测定进行了测试
。
测试了基于菌株
pt22av
的不同制剂，其酵母细胞的组成和浓度各不相同，并通过不同的方法和技术获得
。
[0017]
基于所获得的结果，与以下相比，根据本发明的
papiliotrema terrestris
的菌株
pt22av
已被证明是针对植物病原体的更好的生物防治剂：
[0018]
a)
基于细菌的商业微生物制剂
(
例如，
bacillus subtilis
和
b.amyloliquefaciens)、
酵母
(
例如
aureobasidium pullulans)
和真菌
(
例如
trichoderma spp.)
；
[0019]
b)
许多商业化的植物保护化学产品
。
[0020]
关于与基于细菌和酵母的制剂的比较
(a
点
)
，根据本发明的
papiliotrema terrestris pt22av
已证明产生更好的性能，因为它可以在低得多的细胞浓度下使用而具有相同的功效
。
总体而言，根据本发明的菌株
pt22av
，单独使用或与其他农用化学品
(
杀真菌剂
、
助剂
、
肥料
、
生物刺激剂等
)
组合使用，被证明比其他常用的基于微生物的制剂
(
例如，杀虫剂
)
更有效
。
当在田间和收获后施用时，在空中和根部施用时，可控制植物病原真菌
(
包括产霉菌毒素真菌
)
和其他植物病原体
。
此外，与上述
(b)
所示的化学制剂不同，本发明的菌株不会造成选择抗性病原体群体的任何风险，对人类和环境更安全，作用于更广泛的作物
、
疾病
、
植物生长阶段，对环境条件有较好的适应性，能更好地与各种化学或生物杀菌剂
、
助剂等农用化学品协同组合使用
。
[0021]
另一方面，就与化学产品的比较
(b
点
)
而言，本发明的菌株显示出与多种化学杀菌剂相比，具有相当甚至更高的性能
。
此外，根据本发明，与化学产品不同，
p.terrestris pt22av
不产生任何有毒化学残留物
。
此外，该菌株可以在收获前和收获后施用，不允许病原体群体产生抗药性，与许多农用化学品组合使用时与这些产品相容，并且可以在有机农业中使用农业和害虫综合防治
。
[0022]
根据本发明，已经清楚地证明了基于菌株
pt22av
的治疗对于新鲜细胞和脱水细胞的功效
。
[0023]
根据本发明，包含
pt22av
菌株的制剂是特别有利的，因为如果施用于作物，它们会积极保护植物，促进其生长，刺激针对病原体的系统抗性，减少霉菌毒素的产生和积累，减轻线虫和其他生物和非生物应激源的有害影响
。
此外，根据本发明，
p.terrestris
的菌株
pt22av
在预防
、
抑制和控制影响整个植物
(
地上部分和根
)
的多种疾病
/
病原体方面具有高度活性，具有在田间
、
在收获后
、
在土壤中和用于种子包衣施用的可能性
。
具体地，根据本发明的菌株
pt22av
可以有利地用于根和种子处理以及植物的整个地上部分
(
包括花和果实
)
，并且可以单独施用或与其他农业产品协同组合施用，特别是农药
(
杀螨剂
、
杀细菌剂
、
杀真菌剂
、
杀虫剂
、
除草剂
、
除藻剂
、
杀软体动物剂
、
杀线虫剂
、
杀鼠剂
、
植物生长调节剂
、
驱虫剂
、
化学信息素
、
杀病毒剂
)、
生物农药
、
助剂和其他农用化学品
(
添加剂
、
肥料
、
生物刺激剂
)。
[0024]
因此，根据本发明，与其他已知的生物防治酵母相比，可以有利地使用
p.terrestris pt22av
对抗不同类型作物中的多种病原体，并且对合成化学活性成分具有耐受性，这使得它可以与这些化学品结合使用，如下面的示例所示
。
[0025]
具体地，根据本发明的
p.terrestris
的
pt22av
菌株可以有利地用作生物防治剂
(bca)
，用于在有机农业和综合病害管理
(idm)
中管理植物病原体
。
[0026]
此外，根据本发明，发现菌株
pt22av
具有非常活跃的次生代谢，在细胞外环境中分泌一系列次生代谢产物
。
其中，细胞外聚合物特别重要，这是一组主要由多糖组成的复杂物质
。
这些聚合物的组成和生产非常复杂，据观察，它受到多种因素的影响，包括生物质生产过程中生长培养基的组成
、ph、
温度和氧合作用
。
根据本发明，发现
p.terrestris
菌株
pt22av
产生的胞外聚合物主要由碳水化合物组成
(50-90
％
)
；最有代表性的单体是：甘露糖
、
木糖
、
葡萄糖
、
半乳糖
、
阿拉伯糖
。
这些聚合物的结构与淀粉和糖原非常相似，它确实被组织在由通过
α-(1
→
3)
键连接的单体单元和通过
β-(1
→
2)
键锚定的支链组成的主链中
。
这些化合物主要在营养应激条件下以及在限制细胞生长的所有条件下产生
。
这些聚合物在刺
激植物新陈代谢
、
诱导对病原体的抵抗力
、
改善土壤的化学
、
物理和生物特性
、
促进植物伤口愈合方面具有活性，如果它们分布在地上部分，则其构成病原体渗透的物理障碍
。
[0027]
因此，根据本发明，由
pt22av
酵母菌株产生的前述胞外物质可以有利地用于对抗植物病原体
。
[0028]
关于分子分类学的科学论文强调了
p.terrestris
物种内的高度遗传同质性；这表明在该物种中，与有性繁殖相关的基因重组率较低，并且无性繁殖普遍存在，这是遗传和表型稳定性的保证，因此在该领域
、
其他应用中并且也随着时间的推移具有持续的高性能
。。
[0029]
迄今为止，还没有任何技术和
/
或科学出版物记录了
p.terrestris
物种在收获前阶段
(
在地面或露地
、
土壤施用
、
种子和地上植物部分
)
的生物防治和生物刺激活性的证据
。
因此，根据本发明，首次显示了酵母菌种
p.terrestris、
特别是菌株
pt22av
在收获前阶段的生物刺激活性
(
参见实施例
5)。
[0030]
此外，根据本发明，首次在收获前阶段显示了酵母菌种
p.terrestris、
特别是菌株
pt22av
的生物防治活性
。
根据国际科学文献，唯一报道的
p.terrestris
物种的生物防治活性涉及菌株
ls28(
之前被分类为
cryptococcus laurentii)
，该菌株并未在露地施用，而是仅施用于收获的产品
(
收获后
)
对抗收获后的真菌病原体
。
然而，与申请人相比，
pt22av
菌株的生物防治活性显著高于
ls28
的生物防治活性
。
如下文报道的比较实验数据所示
(
参见实施例
6)
，
pt22av
的功效显著高于
ls28
的功效
。
此外，与
ls28
相比，
pt22av
表现出显著更强的抵抗多种非生物应激的能力
。
[0031]
本发明的
pt22av
菌株对人类和环境安全，其生产过程对环境无影响，满足绿色和循环经济原则，生产副产物可用作土壤有机改良剂，具有利用的可能性食品工业副产品，例如发酵过程中的糖蜜
。
基于
pt22av
菌株的制剂的功效
、
选择性
、
毒理学和生态毒理学特性已在
gap-glp
条件下进行了广泛测试
(
按照有关欧洲微生物农药注册的现行立法的要求
)。
[0032]
就人类毒理学而言，
papiliotrema terrestris
是一种天然存在的非致病性酵母物种
。
对此，
ke
等人
(2018)
报道，静脉注射
(iv)
给予
2.4x 108cfu
和口服给予
1.3x 109cfu
后，
papiliotrema terrestris
对
sprague-dawley
大鼠不具有致病性
。
在细菌回复突变试验
(ames
试验
)
和培养的中国仓鼠肺成纤维细胞
(chl/iu)
细胞的染色体畸变试验中，半乳糖苷酶浓缩物的基因毒性结果均为阴性
。
此外，在
sprague-dawley
大鼠为期
13
周的强饲研究中，任何测试组均未观察到不良反应，未观察到不良反应水平
(noael)
为
2000
毫克
/
千克体重
/
天
[
总有机固体
(tos)1800mg/kg bw/day)]
被确定，这是测试的最高剂量
。
过敏性序列分析显示没有证据表明半乳糖苷酶是过敏原
。
本研究中提供的数据支持这样的结论：
p.terrestris
产生的半乳糖苷酶可安全用于食品生产
。
申请人已经进行了额外的毒理学研究
(
数据未显示
)
，其基于从口腔
、
肺部
、
腹膜内
、
皮肤
、
眼睛刺激和其他相关毒理学测试获得的值证实了根据本发明的菌株
pt22av
具有有利的毒理学特征
。
[0033]
关于环境毒理学，申请人已经进行了欧洲和美国商业注册过程所需的各种研究
(
数据未显示
)
，这些研究证实基于
pt22av
菌株的制剂对环境是安全的
。
研究包括评估鸟类
、
哺乳动物
、
非目标节肢动物
(
如蜜蜂
、
捕食性螨虫
)、
土壤生物
(
如蚯蚓等
)、
水生生物
(
如鱼类
、
水蚤和藻类
)
以及其他非目标生物，并对其进行欧洲和美国的监管机构要求的选择性研究
。
[0034]
根据本发明，
p.terrestris
菌株
pt22av
可以有效地用作有机农业中的广谱杀真菌
剂
(
就作物植物和植物病原体而言
)
，以及用于综合害虫管理计划
。
[0035]
此外，快速定植于植物表面
、
自然开口和伤口的能力使
pt22av
菌株能够有效抵抗通过这些开口渗透宿主的植物病原细菌
(
例如，
pseudomonas spp.、xanthomonas spp.、clavibacter spp.、ralstonia spp.、erwinia spp)。
特别是，菌株
pt22av
在体外和体内生长期间在细胞外环境中产生大量多糖
。
这种非常复杂的基质可以保护菌株免受非生物应激，提高对表面的粘附性并引发植物的系统抵抗力，从而提高对包括病毒在内的多种病原体的耐受性
。
[0036]
此外，根据本发明的
p.terrestris
物种，特别是
pt22av
菌株，还可以有利地施用于土壤，特别是用于改善土壤结构本身和用于线虫控制
。
事实上，将
pt22av
菌株施用于土壤会产生一系列有益效果，包括对土壤和根际微生物组的积极作用
。
多糖基质促进团聚体的形成，从而改善土壤结构，是有用细菌
、
微型动物和动物的营养来源
。
捕食性原生生物，并有助于对保护土壤生态系统至关重要的生态生物地球化学过程
。
此外，包含根据本发明的
pt22av
菌株的制剂是特别有利的，因为如果施用于作物，它们会主动保护植物并促进其生长和对生物应激源
(
例如来自线虫的损害
)
的抵抗力
。
具体地，当用作根处理时，
pt22av
菌株在部分减少线虫增殖的同时，在限制其有害影响方面也特别有效，如通过测量植物高度所示
(
参见实施例
7)。
可能的线虫种类有
meloidogyne spp.、heterodera spp.、globodera spp.、belonolaimus spp.、pratylenchus spp.、rotylenchulus spp.、trichodorus spp.、paratylenchus spp.
等
。
[0037]
pt22av
菌株在广谱浓度下有效，可改善植物的整体健康状况
。
[0038]
根据本发明的
pt22av
菌株拮抗作用的机制有利地允许其施用于广谱宿主植物和病原体
(
真菌
、
细菌和病毒
)
，并且在其施用中在时间方面
(
所有物候阶段
)
以及处理的器官
(
种子
、
根
、
植物外生部分
、
花
、
果实
)
方面具有高灵活性
。
此外，适应非常异质的环境条件
(
湿度
、
温度
、
紫外线照射等
)
的能力使其能够在不同的气候区域中施用
。
[0039]
pt22av
菌株控制植物病害的功效的基础是能够在植物表面或受伤组织上长期存活和持续存在
。
特别是，对脱水
、
氧化应激
、
紫外线辐射
、
渗透应激等环境应激的耐受性和对杀菌剂的耐受性使得
pt22av
菌株能够适应施用环境
。
[0040]
根据本发明，
p.terrestris pt22av
对多种真菌病原体发挥的植物保护作用主要是预防性的
。
特别是，菌株活细胞的施用可以防止在植物-病原体相互作用的早期阶段感染过程的建立
(
例如分生孢子萌发
、
芽管伸长
、
感染位点定植
)。
此外，生物保护是具有不同相关性的几种机制的结果，这些机制调节与病原体以及与同一生态位中的其他微生物的相互作用
。
[0041]
下面列出了表征根据本发明的
pt22av
酵母菌株的生物防治活性的作用模式
。
[0042]-伤口能力：对于大多数坏死性真菌来说，受伤的植物组织代表建立感染过程的主要渗透部位
。
正如文献中已经广泛描述的那样，植物组织通过触发氧化自然过程来响应各种应激
。
其中，受伤的植物组织会引发强烈的氧化反应，导致活性氧
(
主要是超氧阴离子和过氧化氢
)
和其他氧化物质的积累
。
申请人进行的研究证明了生物防治剂
pt22av
如何通过抵抗植物组织由于受伤而产生的活性氧
(ros
：超氧阴离子o2-和过氧化氢，
h2o2)
所施加的氧化应激来有效定植受伤组织
。
根据本发明，所选择的酵母菌株通过两种酶
(
超氧化物歧化酶和过氧化氢酶
)
耐受氧化应激源
。
对氧化应激的抵抗可以被认为是
pt22av
针对收获后伤口
病原体实施的第一个机制
。
特别地，申请人通过对苹果人工伤口中的种群动态的评估，该种群动态的评估表明该微生物如何能够有效地定植于该环境，从而证明了
pt22av
菌株强大的抵抗氧化现象的能力
。
通过将从接种
pt22av
菌株的受伤组织中取出的酵母样品铺板于营养琼脂培养基上来评估菌株群体
。
由分析表明，
pt22av
菌株很快在伤口上定殖，在接种后6小时内浓度加倍
。
此外，申请人通过评价微生物在过氧化氢存在下的生长来进一步研究菌株对氧化应激的抗性
。
为此，将增加浓度的过氧化氢添加到
nyda
琼脂平板中，随后接种
pt22av
株细胞的悬浮液
。
从该分析中可以看出，这种微生物可以有效地耐受高达
30mm
的过氧化氢浓度，因此其氧化应激水平远高于植物组织受伤所产生的氧化应激水平
。
[0043]-竞争空间和营养：
pt22av
通过与真菌病原体有效竞争空间和营养来发挥作用
。papiliotrema terrestris
分离株通过阻止感染过程，有效抑制病原体在其早期生长阶段的发育
。
申请人进行的体内实验强调了在人工伤口中添加外源营养素如何显著降低酵母的生物防治功效
。
此外，在空间竞争中，
pt22av
酵母菌株通过形成胞外多糖胶囊来帮助促进对果实表面的粘附，从而防止宿主果实与病原体之间的接触
(
图
2)。
因此，空间和营养的竞争是
p.terrestris pt22av
对抗坏死性真菌的关键机制，并且与氧化应激抗性密切相关，从而与定植植物组织的能力密切相关
。
有效且及时的空间竞争是
pt22av
的一个主要特征，使其能够有效对抗任何疾病和任何植物培养物
(
即，它赋予这种酵母广谱生物防治活性
)。
更具体地说，
pt22av
对空间
(
进而对营养物质
)
的有效竞争是一种高度复杂的表型性状，依赖于许多基因，这使得该
bca
能够发挥类似于多位点杀菌剂的作用，但具有更广泛的作用机制的范围以及所涉及基因的数量；与这些杀菌剂类比，事实上，在
pt22av
的情况下，竞争使得选择对该
bca
具有抗性的病原体群体变得非常不可能
(
如果不是不可能的话
)。
[0044]-β-1,3-葡聚糖酶活性：
p.terrestris
菌株
pt22av
除了竞争空间和营养之外，还可以通过胞外
β-1,3-葡聚糖酶介导的细胞壁降解直接与真菌病原体相互作用
。
申请人进行的体外研究表明，当在病原体
p.expansum
和
b.cinerea
的菌丝细胞壁存在下培养时，
p.terrestris pt22av
能够产生显著更高水平的细胞外
β-1,3-葡聚糖酶作为唯一的碳源
。
与上述机制相比，该机制在相关性方面被视为第二级
。
[0045]-无抗菌作用：申请人进行的代谢组学研究表明，与具有抗植物病原体活性并在基于微生物的制剂
(
特别是细菌
)
中注册为活性成分的其他微生物不同，
p.terrestris pt22av
不产生具有抗真菌活性的分子
。
在实验条件下，抗生素似乎不参与
pt22av
菌株发挥的拮抗活性，从而排除了真菌病原体产生耐药性的可能性
。
这使得
pt22av
成为比基于细菌的配方更安全
、
更可持续的
bca
，目前细菌的数量高于其他微生物物种
(
真菌和酵母
)。
[0046]-植物抗性诱导：植物具有先天的“免疫系统”来识别和应对病原体
(
真菌
、
细菌和病毒
)
；这种植物的“免疫反应”可以由多种有益微生物触发，从而诱导局部和全身的抗性
。
生物防治酵母可以引发植物对多种病原体的系统抗性，这种作用隐含在其生物防治活性中
。
耐药性的诱导可以由微生物细胞
、
部分细胞触发
。
它们甚至是被植物识别后在细胞外环境中分泌的分子
。papiliotrema terrestris pt22av
产生许多细胞外物质，可以触发宿主植物的系统防御反应，从而提高对病原体的耐受性
。
这种细胞外物质的生产活性是任何其他市售生物防治微生物所无法比拟的
。
[0047]-粘附到植物表面：在生物质生产期间和田间施用后，
pt22av
菌株产生丰富的多糖基质，使酵母细胞能够粘附到固体表面
。
这种细胞外基质促进
pt22av
对植物和受伤组织的
粘附，提高对雨水冲刷的抵抗力，并最大限度地减少生物和非生物应激源的负面影响
。
该活性远高于市售的或文献中描述的任何其他
bca。
[0048]
因此，本发明的具体目的是属于
papiliotrema terrestris
物种的酵母菌株，所述菌株保藏于
westerdijk
真菌生物多样性研究所，保藏号为
cbs147138
，下文中也称为
pt22av
菌株
。
[0049]
根据本发明，所述酵母菌株可以是选自新鲜细胞
、
干燥细胞
、
脱水细胞
、
失活细胞
、
灭活细胞
、
冷冻细胞或水悬浮液中的细胞的形式，包括细胞生物质的衍生物
(
主要是胞外多糖
)
生产过程
。
[0050]
本发明还涉及用于农业用途
、
特别是用于防治植物或作物中的植物病原体的植物检疫组合物，所述组合物包含上文定义的
papiliotrema terrestris
物种的
pt22av
酵母菌株作为活性成分，以及一种或多种赋形剂或植物药理学可接受的佐剂
。
[0051]
根据本发明，所述组合物可以是液体或固体形式
。
[0052]
此外，根据本发明，组合物内所述酵母菌株的浓度可以为每克固体组合物
103cfu
至
10
13
cfu
或每毫升液体组合物
102cfu
至
10
12
cfu。
浓度高于每克或每毫升
107cfu
的固体和液体制剂主要适用于叶面和收获后施用，而浓度低于每克或每毫升
107cfu
的制剂可用于土壤处理
、
堆肥的富集或者用于播种
、
移植或生长植物和种子包衣的其他基质
。
[0053]
本发明制剂中活性成分的浓度表示为每克或每毫升的菌落形成单位
(cfu)。
定量也可以通过其他技术进行，例如实时
pcr、
流式细胞术等
。
[0054]
用于灌溉施肥或水培等的溶液中的
pt22av
菌株浓度范围为每毫升溶液
102至
10
12
cfu。
在涉及使用授粉昆虫的分配系统中，托盘分配器中酵母的浓度范围可以在
102到
10
12
之间
。
[0055]
本发明的组合物可以是片剂
、
胶囊
、
颗粒剂
、
丸剂
、
粉末，例如干粉剂或可湿性粉剂
、
可湿性颗粒剂
、
流体
、
干流体
、
乳液
、
悬浮液
、
溶液
、
分散体的形式
。
[0056]
具体地，根据本发明的组合物可以是以下形式：气雾剂
(a)
；用于传播授粉昆虫的诱饵
(b)
；灰尘
(d)
；干流动性
(df)
；可乳化
(e)
；乳油
(ec)
；可流动
(fl)
；颗粒
(g)
；微囊化
(m)
；颗粒
(p)
；可溶性粉剂
(sp)
；可湿性粉剂
(wp)
；水分散粒剂
(wg/wdg)。
[0057]
更具体地，组合物可以是以下形式：谷物饵料
(ab)
；浓缩饵料
(cb)
；用于种子处理的胶囊悬浮液
(cf)
；胶囊化颗粒
(cg)
；胶囊悬浮液
(cs)
；分散的浓缩液
(dc)
；可再分散乳胶粉
(dp)
；用于干种子处理的粉末
(ds)
；乳油
(ec)
；乳液
、
油包水
(eo)
；种子处理乳液
(es)
；乳液
、
水包油
(ew)
；细颗粒
(fg)
；用于种子处理
(fs)
的流动浓缩物；颗粒状饵料
(gb)
；微粒
(gg)
；飞尘
(gp)
；颗粒
(gr)
；种子处理溶液
(ls)
；微乳液
(me)
；微粒剂
(mg)
；油分散体
(od)
；油混溶性流动浓缩物
(of)
；油混溶液体
(ol)
；油分散粉
(op)
；糊剂
(pa)
；种子涂有农药
(ps)
；悬浮剂
(sc)
；悬乳剂
(se)
；水溶性颗粒剂
(sg)
；可溶性浓缩物
(sl)
；水溶性粉末
(sp)
；种子处理用水溶性粉末
(ss)
；超低容量悬浮液
(su)
；片剂
(tb)
；技术材料
(tc)
；技术浓缩物
(tk)
；水分散粒剂
(wg/wdg)
；可湿性粉剂
(wp)
；用于浆液种子处理
(ws)
的可湿性分散粉剂
。
[0058]
根据本发明的一个实施方案，所述组合物还可包含一种或多种化学化合物，例如合成化合物，和
/
或一种或多种生物制剂，例如微生物，例如细菌
、
酵母
、
真菌
、
病毒
、
藻类
、
所述一种或多种化合物和所述一种或多种生物制剂选自杀真菌剂
、
杀虫剂
、
肥料
、
生物刺激剂
(
例如腐殖酸和黄腐酸
、
蛋白质水解产物
、
海藻和植物提取物
、
壳聚糖和其他生物聚合物
、
无
机化合物
、
有益微生物
)、
大量营养素
(
例如氮
(n)、
磷
(p)
和钾
(k))、
微量营养素
、
诱导剂
、
植物调节剂
、
微生物生物防治剂
、
植物生长调节剂
、
叶面营养素
、
抗生素
、
除草剂
、
杀螨剂
、
食品添加剂
(
例如所有包括以下类别的化合物：抗氧化剂
、
色素
、
防腐剂和面粉处理剂
)、
佐剂
(
例如乳化剂
、
润湿剂
、
分散剂
、
消泡剂
、
螯合剂
、
中和剂
、
溶剂
)、
农业食品微生物
。
[0059]
根据本发明，可以在组合物中使用的赋形剂是例如基于矿物质
(
矿物粉末
)
或有机物
(
简单
、
复合或环状糖
)
的助剂
(co-formulants)、
分散剂
、
乳化剂
、
润湿剂
、
稳定剂
、
增效剂
、
强固剂
。
[0060]
进一步包含一种或多种化学化合物和
/
或一种或多种生物制剂和
/
或一种或多种助剂的上述组合物可以是罐混制剂
(tank-mix)
或共制剂
。
[0061]
具体地：
[0062]
所述叶面养分可以选自氮
、
磷
、
钾
、
钙
、
硫
、
镁；
[0063]
所述微量营养素可以选自铁
、
硼
、
氯
、
锰
、
锌
、
铜
、
钼和镍；
[0064]
所述杀虫剂可以选自无机化合物
、
油
、
植物提取物
、
有机氯
、
有机磷酸酯
、
氨基甲酸酯
、
新烟碱类
、
阿维菌素
、
有机硫
、
有机锡
、
合成拟除虫菊酯；
[0065]
所述诱导剂可以选自化学合成诱导剂，例如水杨酸
、
水杨酸甲酯
、
苯并噻二唑
、
苯甲酸和壳聚糖，或选自植物提取物诱导剂，例如单宁
、
柑橘油，生物类黄酮，例如二氢槲皮素
、
多糖
、
阿拉伯半乳聚糖，多糖和其他植物提取物；
[0066]
所述植物生长调节剂可以选自
(
国际命名
)
生长素
、
赤霉素
、
细胞分裂素
、
乙烯
、
脱落酸
、
嘧啶醇；矮壮素；氯代
ipc
；丁酰肼；氟匹米多；氰氨化氢，氰胺
(h2cn2)
；甲氟肽；缩节胺；多效唑；普罗沙酮钙；琥珀酸
(sadh)、
氯吡脲
。
[0067]
根据本发明的一个实施方案，所述组合物是杀真菌组合物
。
例如，杀真菌作用是通过特定菌株和
/
或通过添加到组合物中的其他杀真菌剂来实现的
。
[0068]
特别地，所述杀真菌剂
(
化学的和
/
或生物的
)
可以选自
(
国际命名法
)2-甲氧基乙基氯化汞
、2-苯基苯酚
、3-乙氧基丙基溴化汞
、8-羟基喹啉硫酸盐
、8-苯基汞氧基喹啉
、
苯并苯唑
、
阿拉酸式苯-s-甲基
、
酰基氨基酸杀真菌剂
、acypetacs、adavelt、agrobacterium radiobacter k84、4-十二烷基-2,6-二甲基吗啉
、
烯丙醇
、
唑嘧菌胺
、
氨基吡芬
、
氨磺溴
、1-氨基丙基磷酸
、
敌菌灵
、
金色制霉素
、
阿扎康唑
、
阿奇霉素
、
嘧菌酯
、bacillus amyloliquefaciens(
以前为
subtilis)
菌株
qst713、bacillus amyloliquefaciens
菌株
ah2、
菌株
it-45、
菌株
fzb24、
菌株
mbi600、
菌株
d747、bacillus mycoides isolate j、bacillus nakamurai
菌株
f727、bacillus pumilus
菌株
qst2808、bacillus subtilis var.amyloliquefaciens
菌株
fzb24、bacillus subtilis
菌株
afs032321、
菌株
gb03、
菌株
iab/bs03、
多硫化钡
、
苯霜灵-m(
＝精苯霜灵
)、
苯达尼
、
苯菌灵
、
苯醌
、
苯他隆
、
苯噻菌胺
、
苯噻菌胺异丙酯
、
苯扎氯铵
、benzamacril、
苯甲酰胺杀菌剂
、
苯扎莫夫
、
苯异羟肟酸
、
苯并维氟吡
、
乙恶嗪
、
联萘丙烯
、
联苯
、
联叔醇
、
联硫醇
、
联苯吡菌胺
、
杀稻瘟菌素-s、
波尔多液
、
硼酸
、
啶酰菌胺
、
溴康唑
、
丁吡酯
、
勃艮第混合物
、
丁硫酸
、
多硫化钙
、
敌菌丹
、
克菌丹
、
卡巴吗啉
、
多菌灵
、
羧甲辛
、
卡菌酰胺
、
香芹酮
、saccharomyces cerevisiae
菌株
as117
的细胞壁
、
切欣特
(cheshunt)
混合液
、
喹菌酮
、
氯苯噻腙
、
氯苯甲乙胺
、
四氯苯醌
、
氯芬唑
、
氯二硝基萘
、
氯硝基
、
氯化苦
、
百菌清
、
四氯喹啉
、
氯唑啉
、
环吡酮
、
氯苯咪唑
、clonostachys rosea
菌株
cr-7、coniothyrium minitans、
氢氧化铜
、
环烷酸铜
、
油酸铜
、
氯氧化铜
、
铜皂
、
硫酸铜
、
碱式
、
铬酸
griseovirides
菌株
k61、streptomyces lydicus
菌株
wyec108、
链霉素
、
硫磺
、
硫酰氟
、
磺胺酮
、
茶树油
、
戊唑醇
、tebufloquin、
叶枯酞，四氧硝基苯
、tecoram、
四氟醚唑
、
噻苯唑
、
噻二氟
、
噻菌腈
、
噻呋酰胺
、
三氯异氰尿酸
、
硫菌灵
、
甲基硫菌灵
、
硫喹诺
、
福美双
、hq25、
噻酰菌胺
、
硫氰苯甲酰胺
、
脱克松
、
唑虫酰胺
、tolprocarb、
甲苯氟苯胺
、
乙酸甲苯汞
、
三唑酮
、
三唑醇
、
三胺磷
、
嘧菌醇
、
丁基三唑
、
三氮嗪
、
三氯酰胺
、trichoderma afroharzianum(
以前为
harzianum)
菌株
t-22、trichoderma asperellum(
以前为
harzianum)
菌株
icc012、
菌株
t25、
菌株
tv1、trichoderma asperellum
菌株
t34、trichoderma atrobrunneum(
以前为
harzianum)
菌株
item908、trichoderma atroviride(
以前为
harzianum)
菌株
imi206040、
菌株
t11、trichoderma atroviride
菌株
i-1237、trichoderma atroviride
菌株
lu132、trichoderma atroviride
菌株
sc1、trichoderma gamsii(
以前为
viride)
菌株
icc080、
氯啶菌
、
三环唑
、
十三吗啉
、
肟菌酯
、
氟菌唑
、
曲福灵
、
灭菌唑
、ucq09、ulocladium oudemansii
菌株
u3、
烯效唑-p、
尿素
、
井冈霉素
、
伐利芬酯
、
乙烯菌核利林
、
伏立康唑
、wlr08、
扎里拉胺
、
环烷酸锌
、
噻唑锌
、
代森锌
、
齐拉姆
、
苯酰菌胺，优选地啤酒菌酯
、
肟菌酯
、
苯菌灵
、
多菌灵
、
噻菌灵
、
戊唑醇
、
抑霉唑
、
戊菌唑
、
腐霉利
、
乙烯菌核利
、
代森锰锌
、
齐拉姆
、
氯氧化铜
、
硫黄
、
咯菌腈和
/
或异丙威
。
[0069]
本发明的植物检疫组合物可以根据本领域技术人员已知的各种方法来制备，例如通过选自喷雾干燥
、
挤出
、
脱水流化床造粒
、
冷冻干燥
、
乳化工艺
、
悬浮工艺的方法，与如前所述的一种或多种化学化合物和
/
或生物制剂和
/
或与一种或多种助剂混合
。
[0070]
本发明的另一个目的是一种试剂盒，其包含：
[0071]
a)
如上文所定义的
papiliotrema terrestris
物种的
pt22av
酵母菌株，或如上文所定义的组合物，和
[0072]
b)
一种或多种化学化合物，例如合成化学化合物，和
/
或一种或多种生物制剂，例如微生物如细菌
、
酵母
、
真菌
、
病毒
、
藻类或它们的组合物
。
化学化合物和生物制剂均可选自杀菌剂
、
杀虫剂
、
肥料
、
生物刺激剂
、
大量营养素
、
微量营养素
、
引发剂
、
植物调节剂
、
微生物生物控制剂
、
植物生长调节剂
、
叶面营养素
、
抗生素
、
除草剂
、
杀螨剂
、
食品添加剂
、
抗氧化剂
、
佐剂
、
农业食品微生物
。
[0073]
具体地：
[0074]
所述叶面养分可以选自氮
、
磷
、
钾
、
钙
、
硫
、
镁；
[0075]
上述微量营养素可以选自铁
、
硼
、
氯
、
锰
、
锌
、
铜
、
钼和镍；
[0076]
所述杀虫剂可以选自无机化合物
、
油
、
植物提取物
、
有机氯
、
有机磷酸酯
、
氨基甲酸酯
、
新烟碱类
、
阿维菌素
、
有机硫
、
有机锡
、
合成拟除虫菊酯；
[0077]
所述诱导剂可以选自化学合成诱导剂，例如水杨酸
、
水杨酸甲酯
、
苯并噻二唑
、
苯甲酸和壳聚糖，或选自由植物提取物组成的诱导剂，例如单宁
、
柑橘油
、
生物类黄酮，例如二氢槲皮素
、
阿拉伯半乳聚糖
、
多糖和其他植物提取物；
[0078]
所述植物生长调节剂可以选自
(
国际命名法
)
：生长素
、
赤霉素
、
细胞分裂素
、
乙烯
、
脱落酸
、
嘧啶醇
、
矮壮素
、
氯代
ipc、
丁酰肼
、
氟匹米多
、
氰氨化氢
(h2cn2)、
甲氟肽
、
缩节胺
、
多效唑
、
普罗沙酮钙
、
琥珀酸
(sadh)、
氯吡脲
。
[0079]
如上所述，杀真菌剂可以属于例如嗜球菌素
、
苯并咪唑
、
甾醇抑制剂
、
二甲酰胺
、
二硫代氨基甲酸盐
、
无机杀真菌剂
、
苯基吡咯或其组合，以及其他化学组
。
[0080]
根据本发明的试剂盒，所述杀菌剂
(
化学和
/
或生物
)
可以选自
(
国际命名
)2-甲氧基乙基氯化汞
、2-苯基苯酚
、3-乙氧基丙基溴化汞
、8-羟基喹啉硫酸盐
、8-苯基汞氧基喹啉
、
苯并苯唑
、
阿拉酸式苯-s-甲基
、
酰基氨基酸杀真菌剂
、acypetacs、adavelt、agrobacterium radiobacter k84、4-十二烷基-2,6-二甲基吗啉
、
烯丙醇
、
唑嘧菌胺
、
氨基吡芬
、
氨磺溴
、1-氨基丙基磷酸
、
敌菌灵
、
金色制霉素
、
阿扎康唑
、
阿奇霉素
、
嘧菌酯
、bacillus amyloliquefaciens(
以前为
subtilis)
菌株
qst713、bacillus amyloliquefaciens
菌株
ah2、
菌株
it-45、
菌株
fzb24、
菌株
mbi600、
菌株
d747、bacillus mycoides isolate j、bacillus nakamurai
菌株
f727、bacillus pumilus
菌株
qst2808、bacillus subtilis var.amyloliquefaciens
菌株
fzb24、bacillus subtilis
菌株
afs032321、
菌株
gb03、
菌株
iab/bs03、
多硫化钡
、
苯霜灵-m(
＝精苯霜灵
)、
苯达尼
、
苯菌灵
、
苯醌
、
苯他隆
、
苯噻菌胺
、
苯噻菌胺异丙酯
、
苯扎氯铵
、benzamacril、
苯甲酰胺杀菌剂
、
苯扎莫夫
、
苯异羟肟酸
、
苯并维氟吡
、
乙恶嗪
、
联萘丙烯
、
联苯
、
联叔醇
、
联硫醇
、
联苯吡菌胺
、
杀稻瘟菌素-s、
波尔多液
、
硼酸
、
啶酰菌胺
、
溴康唑
、
丁吡酯
、
勃艮第混合物
、
丁硫酸
、
多硫化钙
、
敌菌丹
、
克菌丹
、
卡巴吗啉
、
多菌灵
、
羧甲辛
、
卡菌酰胺
、
香芹酮
、saccharomyces cerevisiae
菌株
as117
的细胞壁
、
切欣特
(cheshunt)
混合液
、
喹菌酮
、
氯苯噻腙
、
氯苯甲乙胺
、
四氯苯醌
、
氯芬唑
、
氯二硝基萘
、
氯硝基
、
氯化苦
、
百菌清
、
四氯喹啉
、
氯唑啉
、
环吡酮
、
氯苯咪唑
、clonostachys rosea
菌株
cr-7、coniothyriumminitans、
氢氧化铜
、
环烷酸铜
、
油酸铜
、
氯氧化铜
、
铜皂
、
硫酸铜
、
碱式
、
铬酸锌铜
、
乙酸铜
(ii)、
碳酸铜
(ii)、
碱式
、
硫酸铜
(ii)、
香豆菌酯
、cufraneb、cuprobam、
氧化亚铜
、
氰霜灵
、
环呋虫胺
、
环丁氟虫胺
、
放线菌酮
、
环氟菌胺
、
霜脲氰
、
环戊咪唑
、
环唑醇
、
环丙菌胺
、
环丙呋喃
、
棉隆
、dbcp、
地巴威
、
癸磷锡
、
脱氢乙酸
、
敌虫唑
、
苯氟磺胺
、
二氯萘醌
、
二氯酚
、
二氯苯基
、
二氯唑啉
、
苄氯三唑醇
、
双氯氰菌胺
、
双氯甲嗪
、
二氯兰
、
乙霉威
、
焦碳酸二乙酯
、
苯醚甲环唑
、
氟啶虫胺
、
二甲沙龙
、
二甲硫醇
、
烯酰吗啉
、
灭菌酯
、
烯唑醇
、
烯唑醇-m、
敌诺布顿
、
敌螨普
、dinocap-4、dinocap-6、
敌诺克通
、
敌戊通
、
敌磺隆
、
敌特邦
、
二苯胺
、
双嘧啶酮
、
双吡啶硫酮
、
双硫仑
、
灭菌磷
、
二噻农
、dnoc、
十二吗啉
、
多迪辛
、
多丁
、
多纳托定
、
屈佐索隆
、
克瘟散
、
烯肟酯
、
烯肟菌素
、
依诺嘧菌酯
、
氟环唑
、
依康唑
、
伊特姆
、
噻唑菌胺
、
乙氧嘧啶
、
乙氧喹
、
环氧乙烷
、
乙基汞
2,3-二羟丙硫醇
、
醋酸乙汞
、
溴化乙基汞
、
氯化乙基汞
、
磷酸乙基汞
、
异二唑
、melaleuca alternifolia(
茶树
)
提取物
、reynoutria sachalinensis(
虎杖
)
提取物
、
羽扇豆幼苗子叶提取物
(“blad”)、swinglea glutinosa
提取物
、f500、
恶唑菌酮
、
咪唑菌酮
、
敌克松
、
烯肟菌胺
、
芬氨酯罗宾
(fenamistrobin)、
非那帕尼
、
芬那莫
、
喹唑啉
、
芬布康唑
、
芬呋拉姆
、
环酰菌胺
、
种衣酯
、
苯环腈
、
苯吡菌胺
、
苯吡菌胺
、
苯锈啶
、
丁苯吗啉
、
芬吡嗪
、
芬丁
、
醋酸芬丁
、
氯化芬丁
、
氢氧化芬丁
、
福美铁
、
嘧菌腙
、
吡啶菌酰胺
、
三氟咪啶酰胺
、
氟啶胺
、
咯菌腈
、
氟菌螨酯
、
氟茚唑菌胺
、
氟吗啉
、
氟吡菌胺
、
氟吡咪胺
、
氟吡菌酰胺
、
氟酰亚胺
、
氟曲唑
、
氟沙普林
、
氟嘧菌酯
、
氟喹唑
、
氟唑酰胺
、
氟硅唑
、
氟磺酰胺
、
氟噻菌胺
、
氟唑菌胺
、
氟唑醇
、
氟唑菌酰胺
、
灭菌丹
、
乙膦酸
、
乙膦铝
、
四氯苯酞
(
苯酞
)、
呋贝滴唑
、
呋霜灵
、
呋喃吡啶
、
呋卡巴尼
、
糠醛
、
呋甲环酮
、
呋喃甲酸酯
、gliocladium catenulatum j1446、gliocladium virens gl-21、
麦胶丁
、
灰黄霉素
、
瓜扎汀
、
丙烯酸喹啉酯
、
六氯苯
、
六氯酚
、
己唑醇
、
环辛烯
、
恶霉灵
、
抑霉唑
、
亚胺唑
、inatreq(fenpicoxamid)、
无机油
、inpyrfluxam、
丁基氨基甲酸碘代丙炔酯
、
菌康唑
、
氟苯喹啉
、
异苯膦
、
异菌脲
、
异丙威
、
异非他胺
、
异氟西普仑
、
异丙醇唑
、
异丙硫烷
、
异吡嗪
、
异噻菌胺
、
异戊二酮
、
君思齐
、
春雷霉素
、
醚菌酯
、
海带多糖
、
石硫合剂
(
石灰硫
磺
)、
代森铜
、
代森锰锌
、mandestrobin、
双炔酰菌胺
、
代森锰
、
甲苯尼尔
、
甲卡宾齐特
、
精甲霜灵
、
甲氟康唑
、
嘧菌胺
、
灭虫腈
、
甲哌啶酮
、
甲霜灵
、
甲霜灵-m(
＝精甲霜灵
)、
威百亩
、
甲唑唑啉
、
叶菌唑
、
甲磺威
、
甲呋沙姆
、
甲基溴
、
异硫氰酸甲酯
、
苯甲酸甲酯汞
、
甲基汞双氰胺
、
五氯苯酚甲基汞
、
代森联
、
灭滴灵
、
苯菌酮
、
甲磺伐他汀
、
甲基四丙烯
、
代森环
、
腈菌唑
、
霉菌灵
、n-(
乙基汞
)-对甲苯磺酰苯胺
、
代森钠
、
萘替芬
、
那他霉素
、
印楝油
、
硝基苯异丙酯
、
努阿莫尔
、
辛噻酮
、
呋酰胺
、
有机油
、
邻苯基苯酚
、
肟醚菌酯
、
恶二酰
、
氧硫哌丙林
、
恶唑磺酰
、
恶嗪铜
、
氧喹酸
、
奥泊康唑
、
羟羧菌素
、
土霉素
、pcnb、
稻瘟酯
、
戊菌唑
、
戊菌隆
、
戊氟芬
、
五氯苯酚
、
吡噻菌胺
、
非那丙烯利
、
苯汞脲
、
乙酸苯汞
、
氯化苯汞
、
硝酸苯汞
、
磷二苯
、
亚磷酸盐
、
亚磷酸及其盐
、
亚磷酸
、
苯酞
、
毕卡菌曲
、
吡啶甲酰胺
、
啶氧菌酯
、
哌丙灵
、
植物油
(
混合物
)
：丁子香酚
、
香叶醇
、
百里香酚
、
聚氨基甲酸酯
、
多抗素-d、
叠氮化钾
、
碳酸氢钾
、
多硫化钾
、
硫氰酸钾
、
丙苯唑
、
咪鲜胺
、
腐霉利
、
霜霉威
、
丙环唑
、
丙代森锌
、
丙喹肼
、
丙硫威
、
丙硫菌唑
、pseudomonas chlororaphis
菌株
afs009、pseudomonas syringae esc-10、
吡氟螨酯
、
吡唑醚菌酯
、
唑菌胺酯
、
吡菌胺酯
、
吡菌酯
、
吡丙炔
、
吡嗪氟胺
、
吡唑磷
、
吡菌苯威
、
稗草畏
、
吡啶甲酰
、
吡啶腈
、
啶斑肟
、
嘧霉胺
、
丁吡吗啉
、
吡咯苯酮
、
吡异恶唑
、
吡咯喹酮
、
吡氧氯
、
吡氧呋喃
、
喹丙酮醇
、
喹氮酰胺
、
喹菌唑
、
喹富美林
、
喹甲硫氨酸
、
喹氧芬
、
五氮杂苯
、
雷苯扎唑
、reynoutria sachalinensis、
水杨酰苯胺
、
仲丁胺
、
氟唑环菌胺
、
芝麻油
、
硅噻菌胺
、
银
、
硅氟唑，
sjc17、
叠氮化钠
、
碳酸氢钠
、
次氯酸钠
、
邻苯酚钠
、
五氯酚钠
、
多硫化钠
、
螺菌胺
、streptomyces griseovirides
菌株
k61、streptomyces lydicus
菌株
wyec108、
链霉素
、
硫磺
、
硫酰氟
、
磺胺酮
、
茶树油
、
戊唑醇
、tebufloquin、
叶枯酞，四氧硝基苯
、tecoram、
四氟醚唑
、
噻苯唑
、
噻二氟
、
噻菌腈
、
噻呋酰胺
、
三氯异氰尿酸
、
硫菌灵
、
甲基硫菌灵
、
硫喹诺
、
福美双
、hq25、
噻酰菌胺
、
硫氰苯甲酰胺
、
脱克松
、
唑虫酰胺
、tolprocarb、
甲苯氟苯胺
、
乙酸甲苯汞
、
三唑酮
、
三唑醇
、
三胺磷
、
嘧菌醇
、
丁基三唑
、
三氮嗪
、
三氯酰胺
、trichoderma afroharzianum(
以前为
harzianum)
菌株
t-22、trichoderma asperellum(
以前为
harzianum)
菌株
icc012、
菌株
t25、
菌株
tv1、trichoderma asperellum
菌株
t34、trichoderma atrobrunneum(
以前为
harzianum)
菌株
item908、trichoderma atroviride(
以前为
harzianum)
菌株
imi206040、
菌株
t11、trichoderma atroviride
菌株
i-1237、trichoderma atroviride
菌株
lu132、trichoderma atroviride
菌株
sc1、trichoderma gamsii(
以前为
viride)
菌株
icc080、
氯啶菌
、
三环唑
、
十三吗啉
、
肟菌酯
、
氟菌唑
、
曲福灵
、
灭菌唑
、ucq09、ulocladium oudemansii
菌株
u3、
烯效唑-p、
尿素
、
井冈霉素
、
伐利芬酯
、
乙烯菌核利林
、
伏立康唑
、wlr08、
扎里拉胺
、
环烷酸锌
、
噻唑锌
、
代森锌
、
齐拉姆
、
苯酰菌胺，优选地啤酒菌酯
、
肟菌酯
、
苯菌灵
、
多菌灵
、
噻菌灵
、
戊唑醇
、
抑霉唑
、
戊菌唑
、
腐霉利
、
乙烯菌核利
、
代森锰锌
、
齐拉姆
、
氯氧化铜
、
硫黄
、
咯菌腈和
/
或异丙威
。
[0081]
本发明还涉及如上文所定义的
pt22av
酵母菌株
、
由所述菌株分泌的胞外物质
、
如上文所定义的组合物或试剂盒针对一种或多种植物或作物
(
例如农作物
、
观赏作物
、
林业作物
、
野生物种
、
经济作物
、
公园和花园植物
)
的植物病原体的用途
。
根据本发明，所述酵母菌株
、
胞外物质
、
组合物或试剂盒可以在播种前
、
收获前或收获后使用
。
[0082]
具体地，根据本发明，属于
papiliotrema terrestris
种的酵母菌株
pt22av
在控制植物病原体方面是有效的，因为它通过控制植物病原体的发展并因此限制植物中感染的建立来起作用，而不直接杀死植物病原体
。
因此，上述术语“抗植物病原体”是指控制植物病原
体
。
[0083]
属于
papiliotrema terrestris
种的
pt22av
酵母菌株在生物质生产阶段分泌的胞外物质
(
或次级代谢物
)
本质上是糖类性质的聚合物，其中最常见的单体单元是：甘露糖；木糖；葡萄糖
、
半乳糖
、
阿拉伯糖
。
这些聚合物的结构由通过直链和支链键连接的单体主链组成
。
因此，本发明包括使用来自对抗植物病原体的
papiliotrema terrestris pt22av
生物质生产过程的废水
(
即按原样
(
粗制
)
或浓缩物施用的培养物生长液，具有高含量的
eps(
胞外多糖
)
化合物
)
，即作为针对植物病原体的植物保护剂或生物防治剂
。
[0084]
特别地，根据本发明，酵母菌株可用于直接和间接控制所有对植物有害的生物体
。
例如，该菌株可用于诱导植物的抗性和生物刺激，通过产生多糖和其他代谢物来提高植物对包括病毒在内的病原体的耐受性
。
这种高度复杂的基质可以保护菌株免受非生物应激，提高对表面的粘附性并引发植物抗性的诱导，从而提高对包括病毒在内的多种病原体的耐受性
。
[0085]
基于蛋白质和碳水化合物性质的细胞外聚合物或次级代谢产物的液体或脱水制剂，在
pt22av
菌株的发酵和随后的工业转化过程中积累，可用作植物刺激剂
、
病原体抗性诱导剂
、
非生物应激缓解剂
(
渗透压剂
、
水
、
热
、
紫外线等
)、
愈合膜
、
叶面施用或种子包衣分配中的佐剂
、
微生物生长培养基，包括生物包装
(
整合或替代包装以保存食品等
)。
[0086]
根据本发明的用途，所述一种或多种植物或作物可以选自：谷物，例如小麦
、
大麦
、
黑麦
、
燕麦
、
水稻
、
玉米
、
高粱；果树，例如橄榄树
、
苹果树
、
梨树
、
杏树
、
梨树
、
李子树
、
桃树
、
杏仁
、
樱桃树
、
柿子树
、
香蕉树
、
葡萄树
、
草莓树
、
覆盆子树
、
黑莓树；柑橘类水果，例如橙子
、
柠檬
、
柑橘
、
柑橘树
、
葡萄柚；豆类，如黄豆
、
豌豆
、
扁豆
、
大豆；蔬菜作物，例如菠菜
、
生菜
、
芦笋
、
朝鲜蓟
、
卷心菜
、
胡萝卜
、
洋葱
、
大蒜
、
西红柿
、
土豆
、
茄子
、
辣椒
、
茴香；葫芦科植物，例如南瓜
、
西葫芦
、
西瓜
、
甜瓜；油料植物，例如大豆
、
向日葵
、
油菜
、
花生
、
蓖麻
、
椰子；烟草；咖啡；茶树；可可；甜菜；甘蔗；棉花
。
[0087]
根据本发明，所述植物病原体可以是真菌，例如担子菌纲
(basidiomycetes)、
子囊菌纲
(ascomycetes)、
半知菌纲
(deuteromycetes)、
卵菌纲
(oomycetes)、
有性或无性繁殖的真菌
、
具有活体营养或死体营养活性的真菌
、
原生生物或色藻界
(chromista)。
例如，该菌株可用于控制影响田间和收获后阶段的植物产量的产霉菌毒素真菌，以防止霉菌毒素在任何农作物上积累
。
[0088]
具体地，根据本发明，所述真菌可以选自以下种：
albugo spp.、alternaria spp.、anthracnose、armillaria spp.、ascochyta spp.、aspergillus spp.、blumeria graminis、botrytis cinerea、botrytis spp.、bremia lactucae、cercospora kikuchii、cercospora sojina、cercospora spp.、cercosporella herpotrichoides、cladosporium spp.、claviceps purpurea、colletotrichum spp.、corynespora cassiicola、diaporthe spp.、erysiphe spp.、fusarium graminearum、fusarium oxysporum、fusarium spp.、helminthosporium spp.、leveillula taurica、macrophomina phaseolina、magnaporthe oryzae、magnaporthe spp.、melampsora lini、monilinia spp.、mucor spp.、mycosphaerella graminicola、mycosphaerella spp.、oidium spp、penicillium spp.、peronospora manshurica、peronospora spp.、phaeosphaeria spp.、phakopsora pachyrhizi、phakopsora spp.、phoma spp.、phytophthora spp.、plasmopara viticola、
podosphaera spp.、pseudopernospoea cubensis、puccinia spp.、pyrenochaeta lycopersici、pyrenophora spp.、pyricularia oryzae、pythium spp.、ramularia spp、rhizoctonia solani、rhizoctonia spp.、rhizopus spp.、rhynchosporium spp.、sclerotinia sclerotiorum、sclerotinia spp.、sclerotium cepivorum、sclerotium rolfsii、sclerotium spp.、septoria glycines、septoria spp.、sphaerotheca spp.、stemphylium spp.、stenocarpella maydis、thielaviopsis basicola、thielaviopsis spp.、tilletia spp.、uncinula spp.、uromyces spp.、ustilago maydis、ustilago spp.、venturia spp.、verticillium spp.。
[0089]
进一步地，根据本发明的用途，所述植物病原体可以是农作物的细菌
、
病毒或寄生线虫
。
[0090]
具体地，细菌可以选自以下种：
pseudomonas spp.、xanthomonas spp.、clavibacter spp.、ralstonia spp.、erwinia spp.
；而线虫可以选自以下种：
meloidogyne spp.、heterodera spp.、globodera spp.、belonolaimus spp.、pratylenchus spp.、rotylenchulus spp.、trichodorus spp.、paratylenchus spp.
等
。
[0091]
根据本发明的用途，所述酵母菌株或所述胞外物质或所述组合物或所述试剂盒可以被施用于植物的一个或多个完整的或受伤的部分，所述部分选自种子
、
地上部分
、
叶
、
茎
、
树干
、
蓓蕾
、
小孢子囊
(gems)、
枝
、
茎
、
花
、
果
、
根
。
[0092]
具体地，对于植物地上部分的田间处理，可以使用目前使用的分配设备或空中灌溉系统，例如通过喷雾设备或高架灌溉系统来施用
pt22av
菌株或细胞外物质
。
收获后阶段对水果
、
花卉和鲜切农产品的处理可以使用分配设备进行或添加到清洗水中
。
[0093]
根据本发明，每单位培养表面分布的所述酵母菌株的活细胞数量可以为每公顷
108至
10
15
cfu。
[0094]
根据本发明，基于
pt22av
的组合物的剂量可以根据制剂的类型和施用领域而变化，通常为每公顷几克至几十公斤
。
剂量还可以取决于作物
、
要对抗的病原体
、
疾病的压力
、
天气和其他农艺因素
。
[0095]
根据本发明的用途，如上所述的上述酵母菌株或其胞外物质或组合物或试剂盒可以优选地以酵母菌株的活细胞浓度被施用于固体植物生长基质，例如土壤
。
每克固体生长基质
(
土壤或其他基质
)
范围为
102至
10
12
cfu。
[0096]
根据本发明，可以通过施用基于
papiliotrematerrestris
的
pt22av
菌株的制剂
、
通过在基质中稀释
、
喷雾或用灌溉施肥系统分配来进行土壤处理
。
土壤处理的目的是改善土壤的化学-物理和微生物特性和
/
或控制植物病原线虫
。
[0097]
此外，根据本发明，
pt22av
菌株还可用于处理水培或漂浮作物系统，例如对抗病原体和根部寄生虫；在这种情况下，可以将产品直接施用在营养液中
。
[0098]
此外，所述酵母菌株或所述组合物可以用作种子包衣剂；在这种情况下，菌株浓度范围为每克种子
102至
10
10
cfu。
根据本发明，用作种子处理的
pt22av
菌株可以与成膜剂
、
表面活性剂或增粘剂组合施用
。
[0099]
另外，所述酵母菌株或所述组合物可以通过授粉昆虫来对抗能够通过花渗透宿主的植物病原体
(erwinia spp.、pseudomonas syringae、botrytis cinerea
等
)。
[0100]
根据本发明的用途，所述植物病原体可以选自葡萄上的
botrytis cinerea
和
plasmopara viticola
，草莓上的
botrytis cinerea
，番茄上的
botrytis cinerea
和
phytopthora infestans
，苹果和
/
或梨树上的
venturia inequalis and stemphylium spp.
，核果上的
monilia spp.
；以及马铃薯上的
phytophtora spp.。
[0101]
据本发明，如上所述的
pt22av
酵母菌株
、
其胞外物质
、
其组合物或试剂盒也可以施用于种子，并且其使用可以在温室
、
田间或收获后阶段进行，在生物或整体系统中
。
[0102]
此外，当使用如上定义的试剂盒时，所述组分
a)
和
b)
可以单独或顺序使用
。
[0103]“单独使用”意指以不同形式同时施用试剂盒的组分
a)
和
b)。“顺序使用”意指以任何顺序随后施用试剂盒的组分
a)
和
b)
，各自以不同的形式
。
[0104]
本发明还涉及用于控制农作物中的植物病原体的方法，该方法包括或者由以下步骤组成：在播种前
、
收获前或收获后，向所述农作物或作物生长的土壤上施用有效剂量的
pt22av
菌株
、
其分泌的胞外物质
、
如上文所定义的组合物或试剂盒
。
[0105]
根据本发明的方法的植物致病菌和作物可以是如上所述的那些
。
根据本发明的方法，所述施用可以发生在完整或受伤的一个或多个植物部分上，该一个或多个植物部分选自种子
、
地上部分
、
叶
、
茎
、
树干
、
蓓蕾
、
嫩芽
、
枝
、
茎
、
花
、
果
、
根
。
[0106]
此外，根据本发明的方法，前述组合物的剂量在每公顷
108cf
至
10
15
cfu
之间变化
。
[0107]
一些施用方案的示例，包括
papiliotrema terrestris pt22av
在主要农业作物上的剂量
、
施用量
、
施用方法和施用部位以及针对主要作物病原体的情况，见表
2。
[0108]
表2[0109]
基于
pt22av
的剂型的施加细节
[0110][0111]
[0112]
剂量和分布体积是示例性的并且可以根据疾病压力和植被类型而变化
。
[0113]
现在将特别参考实施例和附图来描述本发明，用于说明性而非限制性目的，其中：
[0114]-图1显示了生物防治剂
pt22av
对
p.expansum
菌丝的定殖
。
在扫描电子显微镜下观察到的
p.expansum
和
p.terrestris
菌株
pt22av
之间体内相互作用的图像
。
酵母菌定植于真菌菌丝中，并通过多糖性质的细胞外基质粘附在菌丝上；
[0115]-图2显示了施用后5天
pt22av
菌株在叶上的定殖
。
该图像显示了在扫描电子显微镜下观察到的施用后5天的酵母-叶相互作用，特别是番茄叶上页和下页上的酵母，还显示了气孔，自然开口的定殖；
[0116]-图3显示了在
28℃
孵育3天后在琼脂培养基上生长的
pt22av
酵母；
[0117]-图4显示了通过分析大亚基核糖体
rna
基因的核苷酸序列并与其他相关物种进行比较获得的
pt22av
菌株的系统发育树；
[0118]-图5显示了通过比较
pt22av
菌株的整个蛋白质组与其他担子菌酵母菌的蛋白质组而生成的系统发育树
。
[0119]
示例
1.papiliotrema terrestris pt22av
菌株的分离和表征
。
[0120]
pt22av
菌株选自意大利中部各种水果和蔬菜的附生微生物群落中分离的酵母菌种
。
[0121]
pt22av
菌株是通过对大亚基核糖体
rna
基因进行测序来鉴定的，清楚地突出了其属于
papiliotrema terrestris
物种
(
图
4)。
[0122]
特别地，
pt22av
菌株的大亚基核糖体
rna
基因区的核苷酸序列如下所示：
[0123]
ccgggaagagctcaaatttgaaatctggcgtgctcagtgcgtccgagttgtaatctatagaggcgttttccgtgccggactgtgtctaagtcccttggaacagggtatcaaagagggtgataatcccgcacttgacacaatgaccggtgctctgtgatacgtcttctacgagtcgagttgtttgggaatgcagctcaaaatgggtggtgagttccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtaccgtgagggaaagatgaaaagcactttggaaagagagttaaacagtacgtgaaattgttgaaagggaaacgattgaagtcagtcgtgactgagaggctcagccggttctgccggtgtattccctcagtcgggtcaacatcagttttgttcggtggataagggcagctggaaggtggcacctccgggtgtgttatagccagctgtcgcatacatcgaatgagactgaggaatgcagctcgcctttatggcggggtcgcccacgtcgag(seq id no:1).
[0124]
申请人通过纳米孔测序技术获得了
pt22av bca
菌株的全基因组序列
。
对整个
pt22av
基因组序列的生物信息学分析可以预测整个蛋白质组，也用于该菌株的分类分析，从而精确定义与相关物种其他菌株的差异
(
图
5)。
[0125]
pt22av
菌株的整个线粒体基因组由以下序列组成：
[0126]
ctatgagtatagcactaggaagctaaccattagggcgaatagccctgtagcttcggctagagcgaatcctagaatagcgtatgtgaatagttgtcctcgaacagcagggtttcgagctgtaccagcgattagagcgctgaatactgtaccgatcccaacaccggctcctgagagaccgatagcggctagaccagcaccaatgaactttgcagcagccattgtgtattgtgattgtctgaaccnnnnnnnnnntcaatgaattgagctttagcctttataatctaaaggctagtgatgacatccatgaacggctatcacctgtataaagacagtgatagaatatatgtgatcatggaggggacagacgtggatctctattatgaactctatagtgcggtagctggatctcagactatattaccgtatctacccttttaggacctataatcatgcttataatatctatagatgg
[0127]
tagattacctaacactcggtgctatagtaggttataggagtattatactcctataaccata
[0128]
aactatgaatggctactatcagcatgagcaatgactctatttaccgctatagtaatggtg
[0129]
tactctaccatttttcctataggatcctacctatccctataagctatagggttttctatga
[0130]
aaatgctctacaatacatgtatgctaacgtgagtcaatgagtatagcctcggaaacttta
[0131]
tttatgcacttctgacgccatgctgaatataatagcgccacatgtatgcatagcttttatc
[0132]
tctctctatacaagttattatttattagtaaatttattactaaatttatttttaataaataaa
[0133]
ttattattattattatattggtatggacggacagagcaagattcgaacttgcggtgggcg
[0134]
ggacccactttgaggttcaagctcaatgccttagaccactaggctatctgtcctgttat
[0135]
ctcatcgactcacctgctacccttaaagaggggtaggaaaaatggtgaaatatagtata
[0136]
ttgtctatctataaacttttataagaatagttacggtcatagatttttatcgtctcgtctct
[0137]
acacaatggctataaccccttactattaaggccagcctatattttttgctgctataggtg
[0138]
acacagaatatttatgttaaagaacataagggggctagtataaagtccaagcataatag
[0139]
ctttgtaacgtatacacggctcacaatcagttgaaggatcggaggtagtacgaacact
[0140]
gatacaacgtataccagtgcagccagagtaaggagaacgaatgctccttggttaagga
[0141]
agtaaaatgggagagcttgaggcataggctgatatgcaacaggcaatgtgataggtgt
[0142]
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[0143]
agactcttacatactttcctttcnnnnnnnnnncttctgacgccatgctgaatataata
[0144]
gcgccacatgtatgcatagcttttatctctctctatacaagttattatttattagtaaattt
[0145]
attactaaatttatttttaataaataaattattattattattatattggtatggacggacag
[0146]
agcaagattcgaacttgcggtgggcgggacccactttgaggttcaagctcaatgcctt
[0147]
agaccactaggctatctgtcctgttatctcatcgactcacctgctacccttaaagaggg
[0148]
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aacacttgagctatggtaaatagtgggggtctattattatgctacccattactaccctttt
[0622]
taggttagttaaggaaaagtaaagcggannnnnnnnnntagctaggagaatacaggg
[0623]
atacatgggatcgaaccacgcctaagagctttggagactcttgtactaccactatacga
[0624]
tatccctatcaggcttaggaccggacataatatctatcatcttaatagataggggggctat
[0625]
catgcctattcacaacagatcatgatagtatgataagctatgggtcaagccgcgggctc
[0626]
gaaccgcgcacctctccgaccacaacggaacgctctgccaaatgagctagaatgacct
[0627]
gtgttatggtcataccaatacaccagaggaataataatgcttagaggcaataatatatta
[0628]
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[0629]
tacaagacccacgttgcaccattcaactacagaggctcatagtgatcgataaagaccc
[0630]
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[0631]
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[0632]
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[0633]
gggtctattattatgctacccattactaccctttttaggttagttaaggaaaagtaaagc
[0634]
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[0635]
ggctgcaatgctgccaaattacactaccccgcgattgattatgaccatattatatataaa
[0636]
gacaggtttatctccgtactcggacgcgataggagtcgaacctacaactggtcatccca
[0637]
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[0638]
cataggtgagtaagcctataataatgggtcatactattaacgataggttaaattaaatcct
[0639]
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[0640]
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[0641]
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[0642]
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[0643]
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[0644]
ggcagcccttatccattgggtgcttagctgccctgcggtggctcattaataggcacaac
[0645]
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[0646]
gctaataaagcacagcgggtataagctatactgcttcacagcgtattgacaatagtgtta
[0647]
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[0648]
ctaccgtgcaggatagttataggctctgagccttatagtcgttggacgtgatactttaga
[0649]
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[0650]
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[0651]
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[0652]
gtgtaagcatggcttgtagtgccttgtgatgggcctttgtaatcgcaagcttgtattgct
[0653]
tttgtccatcctttccataacggtcagcacggacagtagtggggatacccatggcagta
[0654]
atggccgctgctaggcgtacgcaatctgcatgagtatagctatttacgtagatgaatacg
[0655]
gtactgtttgcgatgtcatatgagccgtcactcatgatgagatgggccagtacaacagg
[0656]
cgtcacaagatccttaatcatagccggaactaccttgatccactcaccagcagccccca
[0657]
tcacataaaacatattgtgatattggttgaaaacgccgagagaaagagtcttcagccg
[0658]
gaattgtccagagggtagtgtagtaacccccgtttggcagaactggctaaatagtccat
[0659]
atacccaataggcataatcacgataaggggccccaaaagaccattccaggcgtgtatta
[0660]
gatgtagcacttgaacgcgatgcatggctatcgcccagaagttgtccaataaccacttg
[0661]
gtgtaggtaatatgggagcattacaatggatcgtagaccccgaataatttcgcttgtaa
[0662]
agcgttgaagaagttgtagtgttgatgtcatagttgttttttgttgattgaattaaatat
[0663]
atgtcgcttaagcgaacccaactcacgtagctccttagactgcgaacagcagtaccct
[0664]
tccaagcttgtgcacctggaggatgagctgagtcgacatcgaggtcgcaaacagcac
[0665]
gggcgatatgaactctcgcgtgctataacgctgttatccctagcgtagcgttaatcgcct
[0666]
agcccagagtgtaccctgacacgtctggggttcacttggccatgcttgcgcactttaa
[0667]
gcactgctcagtgctatcaatcaggcacccattcatgtccatgaacgatagtagcccct
[0668]
acatgggcaataccttaaaaaaggctattcgggtttccatcccgggcaagggtgccata
[0669]
cgtggaggcctccggtactgtataggaggcgaccgtcccagtcaaactagctgatgac
[0670]
ctatcctagcccattgcccgtaagagcggggcttcactaccacgaatcctcatggcggt
[0671]
gtaatagtcgaacgacatacttccccagattcatgtggcgaccggccatcactagtaaa
[0672]
gctgcatagggtcttcttgccctgctgtgctaaaaccgcatcttcacggcttattcagt
[0673]
ttcgctgaggggcccccggagacagcgggtgcgtcgtgaccctcttcatgcgggacca
[0674]
taattagtggccaaggaatttcgctaccttagcacccttatggttaaggcggtcgttta
[0675]
cctgagttaggtacacgttgaagcccttaagctctacgcagtacattcactctaggcac
[0676]
cggacaagggacggcccctatacgagccacagctggtgctgggcatagcagggacct
[0677]
gtgttcttggtgcacagtcgcacaccccgttccactgcgtccagccaggatgtttaatt
[0678]
tctaagttaaaactaagcttaaaaaataaactatccccataagctggacacccttatag
[0679]
taggacgtacgggtttctgttgccgagttcctttgggagccctatctctcactctggtg
[0680]
tactccaccacgggacctgtgtcggtcataggcacggtaaacgcacgcagcttcaagg
[0681]
catatttattatatagtatgctcagcttgtgttaactcatcgctttatacttagagaccgg
[0682]
tttaactcaggatgactgccattgtctatctgagacccaccccgttcaagtgcaaggtg
[0683]
tctagaccttgtatcgctactcgtgtcgccatgctctatccacgttgtccagacaatgct
[0684]
acactgcccttctttcaacatgggtgctcatctaccctataatcttactacatcattatta
[0685]
ttatagcccgcacccgcccatgttacaaacccctttgggggtaagagcaggtgaggca
[0686]
tgtgaactttagacataaatacccctatctttcatgaaaaagataggtaaataatattata
[0687]
tgtttacagttttagtaagtatttataggcgttgtgtgggacgatagctgagacccgttt
[0688]
atcttcggcgcactggtactcggccactgggttgttacaccatcgttaacaggtggcta
[0689]
cctccaggcacactgcatgactgtcattgtagcagcacctccttacgtgtcatttagct
[0690]
atatctgtttgggtcctcgctcaacgctcatgactgtcttcatctaggctgctgacctta
[0691]
tcgcctacagcctgtgtacaggacgtagtagtcccccttccatggtaagctacccctga
[0692]
tagagcacggatgccccccagaactgcactcatttcctataaaacctcctagatggtga
[0693]
tcttatattaaataaatacatggcggcctgaacagtacagggtcctaccactcgatgcct
[0694]
gtctgacgccttaacgtctttcgatgagagccggctagctcgctgttagataggcctat
[0695]
cacccctagcctgagctcgtcagagtacaatacaacggacacctgttcggcctctgtc
[0696]
atggccatcacacgtcaatcaagtacttaaaatacttggacgtaagaggacacaacag
[0697]
gcctggcccaagctagatcacagcggttcaggtctgggcaggaggactaattccccta
[0698]
ttgcaccataataagcaccaatatagcctattgactataactgacacatatcacatcatta
[0699]
cctttatcaatcatttctattgtaatgatccatacctgatttcaccaatttatagtgtagct
[0700]
atatctgacggtttatctgatataacaacaaactaaaactgatggtcaatggcttatatt
[0701]
ggtaggagatgtatggatagcaatgggcgattttgtctgtcgtttaggctattggcctc
[0702]
gccctccttcccaactcggcgacccattatgcaaaaggtacgctgtcgggcgttactat
[0703]
ggcgatcctagaaacccgaccatagcattgcagcccttcagctgcttatggaccatagc
[0704]
tgcttcaggctctatttcactgcggtacaaccgctctctttcatcgttcactcgcgttac
[0705]
tattttctatcactcggaccacctattagccgttgggagagatcccaatcactctacaaa
[0706]
atgcagaatgctctttaacacatcagcagtcacacgggacttttaccctctatggttatc
[0707]
tggcgttccatccagttcaaactgtcgatgacatgttacagctacacctacttttcgct
[0708]
cgccgctactaaggaggtacggttggttgcctgtaggccctactatgatgattcacttt
[0709]
gggccatggctatcattgatttaccgtgaggttgtcattaattgacctttggactagggc
[0710]
nnnnnnnnnncaacaaaagatagtgtgtttcctactactcattactaaccccttctaat
[0711]
tagaattaccctaaccccaccaaaggggggtaactggtgggttaaaaggtaggtaaaa
[0712]
gtaatagttactccactagtcataatggttataggtgtaggtactcactcatgaaattat
[0713]
gaccatgagtgttcataaataactatgaccatgagtataactagtagtattggtggttaa
[0714]
aaagtttaatggtaatagaatatggcttatgcttatgatgggtggggtctataatacatgaatgtactatggacacccgggtttggtggtcataat(seq id no:2).
[0715]
pt22av
菌株核糖体基因的整个编码区由以下序列组成：
[0716]
acctggttgatcctgccagtagtcatatgcttgtctcaaagattaagccatgcatgtctaagtataaacaaattcatactgtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttgatggtatcttgctacatggataactgtggtaattctagagctaatacatgctgaaaagccccgacttctggaaggggtgtatttattagataaaaaaccaatgggtgcaagccctctatggtgattcataataacttctcgaatcgcatggccttgcgccggcgatgcttcattcaaatatctgccctatcaactttcgatggtaggataggggcctaccatggtatcaacgggtaacgggggaattagggttcgattccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggnnnnnnnnnnatcccgacacggggaggtagtgacaataaataacaatatagggccctattgggtcttataattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaactggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccagtagcgtatattaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagtcgaacttcgggcctggctgggcggtccgccttacggtgtgtactgtccggccgggccttacctcatggtgagcccgtatgccctttactgggtgtgcggtggaaccatgaattttaccttgagaaaattagagtgttcaaagcaggcataagcccgaatacattagcatggaataatagaataggacgtgcggttctattttgttggtttctaggatcgccgtaatgattaatagggacggtcgggggcattagtattcagttgctagaggtgaaattcttagatttactgaagactaacttctgcgaaagcatttgccaaggacgttttcattgatcaagaacgaaggttaggggatcaaaaacgattagataccgttgtagtcttaacagtaaactatgccgactagggatcgggccacgttaatttctgactggctcggcaccttacgagnnnnnnnnnnttctggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggtgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacatagtaaggattgacagattgatagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgataacgaacgagaccttaacctgctaaatagtcaggccggcttcggctggtcgtcgacttcttagagggactgtcggcgtttagccgacggaagtttgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgctacactgactgagccagcgagtttatcaccttagccgagaggcttgggtaatcttgtgaaactcagtcgtgctggggatagagcattgcaattattgctcttcaacgaggaatacctagtaagcgtaagtcatcaacttgcgttgattacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgctactaccgattgaatggcttggtgagatttccggattggcgttggggagccggcaacggcacccttggctgagaagctactcaaacctggtcatttagaggaagtaaaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattattgattggtcgaaagaccttatcagattctaccacctctgtgaaccgttgacctccgggttaataatcaaacatcagtgtaacgaacgtaagagtatcttaacgaaacaaaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgccttttggtattccgaaaggcatgcctgtttcagtgtcatgaaatctcaatctaatatgttttctgaacatgttagacttggacttgggcgtctgccagtgatggctcgcctcaaatgacttagtggaacatcccacatcagtgttagacgtaata
[0717]
agtttcgtctctccttgtggtgatgactgctcagaacctgccatcgcgcacttttgact
[0718]
ttgacctgaaatcaggtagggctacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagga
[0719]
aaagaaactaacaaggattccctagtaacggcgagtgaaccgggaagagctcaaatt
[0720]
tgaaatctggcgtgctcagtgcgtccgagttgtaatctatagaggcgttttccgtgccg
[0721]
gactgtgtctaagtcccttggaacagggtatcaaagagggtgataatcccgcacttga
[0722]
cacaatgaccggtgctctgtgatacgtcttctacgagtcgagttgtttgggaatgcagc
[0723]
tcaaaatgggtggtgagttccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaa
[0724]
caagtaccgtgagggaaagatgaaaagcactttggaaagagagttaaacagtacgtg
[0725]
aaattgttgaaagggaaacgattgaagtcagtcgtgactgagaggctcagccggttc
[0726]
tgccggtgtattccctcagtcgggtcaacatcagttttgttcggtggataagggcagct
[0727]
ggaaggtggcacctccgggtgtgttatagccagctgtcgcatacatcgaatgagactg
[0728]
aggaatgcagctcgcctttatggcggggttcgcccacgtccgagcttaggatgttgac
[0729]
ataatggctttaaacgacccgtcttgaaacacggaccaaggagtctaacatatctgcg
[0730]
agtgtttgggtgtcaaacccaagcgcgtaatgaaagtaaacgtaggagggatccgca
[0731]
aggagcaccttcgaccgatctggatcttctgtgatggatttgagtaagagcatatatgc
[0732]
tgggacccgaaagatggtgaactatgcctgaatagggcgaagccagggaaactctgg
[0733]
tggaggctcgtagcgattctgacgtgcaaatcgatcgtcaaatttgggtataggggcg
[0734]
aaagactaatcgaaccatctagtagctggttcctgccgaagtttcctcaggatagcag
[0735]
aaactcgcatcagttttatgaggtaaagcgaatgattagaggaattggggacgaaacg
[0736]
tccttaacctattctcaaactttaaatgtgtaagaaggacttgtcacttaattggacga
[0737]
gtccatgcgaatgagagtttctagtgggccatttttggtaagcagaactggcgatgcg
[0738]
ggatgaaccgatcgtgaggttaaggtgccggaatacacgctcatcagacaccacaaag
[0739]
gtgttagttcatctagacagcaggacggtggccatggaagtcggaatccgctaaggag
[0740]
tgtgtaacaactcacctgccgaatgaactagccctgaaaatggatggcgctcaagcgt
[0741]
gttacccatacctcaccgtcggcgttgaagtgacgcgccgacgagtaggcaggcgtgg
[0742]
aggtttgtgaagaagccttggcagtgatgctgggtgaaacagcctctnnnnnnnnnn
[0743]
agatagggaagctccgtttcaaagtgcacgcttatccgtgccgcctatcgaaagggaa
[0744]
tccggttaagattccggaaccaggatgtggatcattgacggcaacgtaaatgaagttg
[0745]
gagacgctggcaagggccccgggaagagttctcttttctccttgaccgcttacgacct
[0746]
cgaaatcggattatccggagatgaggttatatggcgggcagagcacgacacctctgtc
[0747]
gtgtccggtgcgtccttgacagtccttgaaaatccgacggaacgtataagtctcacgc
[0748]
ctggtcgtactcataaccgcagcaggtctccaaggtgaacagcctctagttgatagaa
[0749]
caatgtagataagggaagtcggcaaaatagatccgtaacttcgggaaaaggattggct
[0750]
ctaagggttgggtacgtcgggccattggcggaacagagctggaccaggtcggacttg
[0751]
ctggggcaacccggctggactggctcggaccggcgatgggatgnnnnnnnnnnaact
[0752]
atgactctcttaaggtagccaaatgcctcgtcatctaattagtgacgcgcatgaatgga
[0753]
ttaacgagattcccactgtccctatctactatctagcgaaaccacagccaagggaacgg
[0754]
gcttggcagaatcagcggggaaagaagaccctgttgagcttgactctagtttgacatt
[0755]
gtgaaaagacatggagggtgtagaataagtgggagcttcggcgccggtgaaatacca
[0756]
ctacctccatcgtttttttacttattcaatgaggcggagctgggattaacgtcccacctt
[0757]
tttgtcttaaggtcctttacgggctgatccgggttgaagacattgtcaggtggggagtt
[0758]
tggctggggcggcacatctgttaaaagataacgcaggtgtcctaagggggactcatgg
[0759]
agaacagaaatctccagtagaacaaaagggtaaaagtccccttgattttgattttcag
[0760]
tgtgaatacaaaccatgaaagtgtggcctatcgatcctttagtccctcggaactcgagg
[0761]
ctagaggtgccagaaaagttaccacagggataactggcttgtggcagccaagcgttca
[0762]
tagcgacgttgctttttgatccttcgatgtcggctcttcctnnnnnnnnnnggagtaac
[0763]
tatgactctcttaaggtagccaaatgcctcgtcatctaattagtgacgcgcatgaatgga
[0764]
ttaacgagattcccactgtccctatctactatctagcgaaaccacagccaagggaacgg
[0765]
gcttggcagaatcagcggggaaagaagaccctgttgagcttgactctagtttgacatt
[0766]
gtgaaaagacatggagggtgtagaataagtgggagcttcggcgccggtgaaatacca
[0767]
ctacctccatcgtttttttttacttattcaatgaggcggagctgggattaacgtcccacc
[0768]
tttttgtcttaaggtcctttacgggctgatccgggttgaagacattgtcaggtggggag
[0769]
tttggctggggcggcacatctgttaaaagataacgcaggtgtcctaagggggactcat
[0770]
ggagaacagaaatctccagtagaacaaaagggtaaaagtccccttgattttgattttc
[0771]
agtgtgaatacaaaccatgaaagtgtggcctatcgatcctttagtccctcggaactcga
[0772]
ggctagaggtgccagaaaagttaccacagggataactggcttgtggcagccaagcgt
[0773]
tcatagcgacgttgctttttgatccttcgatgtcggctcttcctgtcnnnnnnnnnnagaattcggtaagcgttggattgttcacccactaatagggaacgtgagctgggtttagaccgtcgtgagacaggttagttttaccctactgatggagggttatcgtaacagtaattgagggtagtacgagaggaactgctcattcagataattggtatttgcgcctgtccgatcgggcaatggcgcgaagctatcatctgctagattatggctgaacgcctctaagtcagaatctgtactggaaacgatgatgttggtcccgcatgtgttagttgtgtcaaaataggcttcggctgtgaaccatatctgggctgggttgtttggacggaaaggtccttgcagcttgctcttgattgaaatggaatatacgcggggggtgaatcctttgcagacgacttgaattggaacnnnnnnnnnntagtagagtagccttgttgctacgatctactgaggctaagcccttgt(seq id no:3).
[0774]
pt22av
菌株的
coi1
基因由以下核苷酸序列组成：
[0775]
atggctagccgatggctcttctctacaaacgccaaggatattggtaccctttatatcctttttgctgtctttaccggtcttctgggtactgcgttcagtgtacttatccggatggagctatcagctcctggtaaccagttcctttctggtaaccaccacctctacaacgtaattgctacaactcacggtatcatgatgatttacttcatggtggtacctgctatggctgggttcgctaactacatggctcccgttcttatcggtgcgccggacatggcgttcccacggctgaacaacatcagcttctggctactacctcctgcaatcgttcttatcctttcaagcgtcttcgtggaacaaggtatgggtagcggttggactatgtacatgcctctaacaggtgtacaatcacacagtggtggatcagttgatctagctgtattcagcctgcacctctcagggatttcatctctacttggtgccattaacattatcactacaatccttaacatgcgagctccagggctacgcctacacaaggcacctctattcgtatgggcgatgctatcacagtcagttattattattctatgtattccagttctagccggagctcttactatgatccttactgaccgtaacttcaacacatcattcttcgaccctgctggaggaggggaccctgtcctataccaacacctattctggttcttcggacaccctgaagtatacctaatgattatccctggatttggtatggttagccacgttgtttcaacattcagtggaaagcctgttttcggttaccttggtatggtgtacgccattgcctctatcggtgtgcttggattcattgtatggagccaccacatgtacgccgtagggatggacgtagacacacgagcttacttcacagctgcatctatgattattgcggtacctacaggtatcaaggtcttcagttggctagcgactgcttacggtggttctatccgactgctagcacctatgctattcgctctaggattcgtcggtctgttcactattggtggactgacaggtgtagttctagcgaacgcgagcgttgacgtagcgatgcatgacacatactacgttgtggctcacttccactacgtgctttcaatgggtgccgtattcagtatctttgccgggttctactactgggctccaaagatgttcggtaagatgtacgaagaacacctagctcaagcgcacttctggacattcttcatcggtgttaacatgacatttatgccacaacacttcctaggactacaaggaatgccacgacgattcgctgactaccctgacgcttacgcgggatggaacctaatctcatcatggggttcattcgttagcgtctctgctactcttctgttcctgtacactgtttacgacatgttcactaacgacaa
gtacgttggtgacaacccatggggagaaccgctatacttcacggacaacctaacgtacgaacgaagcacacggttcgcctacacaatcgagtgggtactaccatcacctactccacaccacgcattcgacatgctacctatccaatcatag(seq id no:4).
[0776]
papiliotrema terrestris pt22av
菌株的分类学分类如表1所示
。
[0777]
示例
2.papiliotrema terrestris pt22av
的拮抗能力及作用机制分析
。
[0778]
pt22av
菌株首先通过分析其拮抗能力和作用机制在体外进行表征
。
该测定由纯培养物组成，其中评估了真菌病原体在琼脂生长培养基上的径向生长，并与使用
papiliotrema terrestris pt22av
作为生物防治剂的双重培养物中相同植物病原体的生长进行比较
。
通过评估不同条件下真菌病原体径向生长的差异，可以量化拮抗酵母产生的抗真菌效果
。pt22av
菌株对所测试的各种真菌病原体产生的平均抑制约为
18
％，具体而言：
penicillium expansum25
％；
monilinia fructigena and m.laxa 20
％；
botrytis cinerea 15
％；
fusarium spp.10
％；
rhizoctonia solani 20
％；
alternaria solani 15
％；
aspergillus spp.25
％；
colletotrichum spp.20
％
.
[0779]
示例
3.papiliotrema terrestris pt22av
与已知产品相比的功效证据
。
[0780]
根据下列指南，
pp 1/135(4)
植物毒性评估
、pp 1/152(4)
功效评估试验的设计和分析以及
pp 1/181(5)
进行和报告功效评估试验，包括良好的实验实践，对
papiliotrema terrestris
种的
pt22av
菌株进行了
gap
认证的功效试验
。
特别是，在3年期间
(2018-2019-2020)
在4个欧盟国家对6种作物进行了
32
项功效和选择性测试，针对多种生物营养和坏死营养真菌病原体，在田间和收获后期进行
。
[0781]
表
3a
和
3b
显示了在田间或收获后施用的
papiliotrema terrestris pt22av
对区域部分真菌病原体
(
表
3a)
以及作为土壤接种剂和
/
或在滴灌施肥中对真菌病原体的功效
。
不同剂型
(wg
：可湿性颗粒剂-wp
：可湿性粉剂-sc
：浓缩悬浮液
)
和不同剂量的土传真菌病原体
(
表
3b)。
[0782]
wg
和
wp
剂型具有以下成分：脱水酵母细胞
、
冷冻保护剂
(
单糖和二糖
)、
矿物质或有机性质的惰性物质
、
崩解剂
。
组成制剂的不同组分的数量比根据制剂的微生物浓度而变化
。sc
剂型具有以下成分：酵母细胞
、
水
、
稳定剂
。
[0783]
使用以下公式将
pt22av
菌株的有效性与生物和化学竞争者的有效性进行比较：
[0784]
{[(
竞争者功效
x 100)/pt22av
功效
]-100}x-1。
[0785]
在此公式中，
pt22av
的功效被视为
100
％，第一步计算了杀菌剂竞争对手的功效百分比
。
随后，计算两种处理之间的百分比差异
(-100)。
最后，通过乘以-1
，结果将在比较中获得正号，表明
pt22av
具有较高功效，而在比较中获得负号，表明
pt22av
显示较低功效
。
[0786]
表
3a
[0787]
pt22av
剂型与杀菌剂竞争对手
(
部分真菌病原体
)
之间的功效比较
。
[0788]
[0789]
[0790][0791]
表
3bpt22av
制剂与杀菌剂竞争对手
(
土传病原体
)
之间的功效比较
。
[0792]
[0793][0794]
示例
4.papiliotrema terrestris pt22av
与杀菌剂的相容性及其在综合疾病管理方案中的功效
。
[0795]
基于
papiliotrema terrestris
菌株
pt22av
的微生物制剂可与合成化学活性成分结合有效施用于害虫综合治理
(ipm)。
这种可能性源于
pt22av
酵母能够耐受具有杀菌作用的活性成分，从而允许两种制剂同时或连续使用
(
表
4)。
[0796]
本发明的酵母对象的抗性或耐受性是通过以下两种主要方法建立的：
[0797]
i)
将合成的化学活性成分以递增的浓度掺入琼脂生长培养基
(nyda
：营养肉汤
8gr l-1
；酵母提取物
5gr l-1
；葡萄糖
10gr l-1
；琼脂
20gr l-1
)。
将适当稀释的
pt22av
菌株的细胞悬液分布在含有具有抗真菌分子的生长培养基的培养皿上，因此将在存在杀真菌剂的情况下微生物的生长与阴性对照
(
不含杀真菌剂的
nyda)
中的微生物生长进行比较
。
[0798]
ii)
将测试的活性成分按照制造商建议的浓度溶解在无菌蒸馏水中
。
将基于
pt22av
酵母的制剂悬浮在这些溶液中，并在
20℃
下以
150rpm
搅拌孵育1小时
。
蒸馏水中的酵母悬浮液用作阴性对照
。
将适当稀释的细胞悬浮液接种到生长琼脂培养基
(nyda)
上以验证其活力
。
[0799]
第一种测试方法强调了
pt22av
酵母对大多数测试的杀菌剂具有良好的抗性，尽管测试的各种活性成分之间的耐受性水平不同
(
表
4)。
[0800]
第二种测试方法允许在罐混合条件下建立对合成化学活性成分的耐受性，假设在喷涂机罐中的停留时间为一小时
。
在这种情况下，与阴性对照相比，没有测试的杀菌剂会导致
pt22av
酵母的活力降低
。
出现的广谱抗性是由于酵母处于由制剂工艺决定的静止状态，并且再水化后的细胞活化时间约为2小时
。
在这段时间里，酵母细胞比活跃生长的酵母细胞对非生物应激的抵抗能力更好；这使得酵母可以与所有抗真菌活性成分同时使用
。
[0801]
表4不同杀菌剂的最低抑菌浓度
[0809][0810][0811]
wp
＝可湿性粉剂
,wg
＝水分散粒剂
[0812]
根据
tuckey
检验，用相同字母标记的值在统计学上没有差异
(p《0,05)。
[0813]
示例
6.pt22av
和
ls28
分离株在三种代表性作物中的功效比较
。
[0814]
在意大利莫利塞大学
(
农业
、
环境和食品科学系植物病理学实验室
)
进行了为期5年
(2016
年至
2020
年
)
的田间和收获后试验，比较了
pt22av
和
ls28
菌株的功效，针对多种生物营养型和坏死营养型真菌病原体对7种作物进行田间试验，对4种作物进行收获后试验
。
[0815]
按照表2中描述的方案施用
pt22av
和
ls28。
对于田间试验，在收获时评估功效，而在收获后，当未处理的对照中获得至少
10
％的感染时进行测量
。
在每公顷
cfu(
菌落形成单
位
)
水平相同的情况下，观察到菌株
pt22av
的功效显著高于菌株
ls28。
菌株
pt22av
和
ls28
之间的施用方案在剂量
、
作物植物和相关植物病原体方面的比较如表6所示
。
[0816]
表6[0817]
pt22av
与
ls28
分离株在三种代表性作物的药效比较
[0818][0819][0820]
申请人的类似比较显示，与
ls28
相比，
pt22av
抵抗多种非生物应激的能力显著更强
(
表
7)。
这种对应激源的更强的抵抗力与环境中更高的适应性
、
存活率和活力以及植物组织的定植有关；这些特征反过来又与植物病原体的生物防治活性直接相关
。
此外，对应激源的更强抵抗力与酵母生物质生产阶段的更大抵抗力和存活率以及脱水和冷冻干燥方法
(
配制过程的常见步骤
)
造成的应激有关，从而确保生产更多数量的用于生物防治的重要和活性酵母生物质
。
特别是，生物质生产过程导致菌株
pt22av
的
cfu
浓度平均比菌株
ls28
高
70
％
。
此外，连续的配制步骤进一步将冷冻干燥过程中的
pt22av
菌株的
ls28cfu
浓度降低了
约
40
％，而使用流化床配制时则降低了
90
％以上
。
[0821]
表7应激对琼脂培养基上
pt22av
和
ls28
生长的影响
。
[0822][0823]
符号
(+++)
代表高度耐受
,(++)
适度耐受，
(+)
低耐受和
(-)
敏感
[0824]
示例
7.pt22av
对番茄植株上的线虫
(meloidogyne spp.)
的功效
。
[0825]
pt22av
菌株已施用于番茄植株，如表2所示，并评估了该菌株对抗
meloidogyne spp
的功效
。
表8中报告的结果表明，当施用
pt22av
菌株作为根部处理时，在部分减少线虫增殖的同时，它在限制其有害影响方面也特别有效，如通过测量植物高度所示
。
[0826]
表
8pt22av
对番茄植株上的线虫
(meloidogyne spp.)
的防治效果
[0827][0828]
[0829]
根据
tuckey
检验，用相同字母标记的值在统计学上没有差异
(p《0,05)。
[0830]
已经根据其优选实施例描述了本发明，用于说明性而非限制性目的，但是应当理解，本领域技术人员可以做出变化和
/
或修改，而不脱离如所附权利要求所定义的相对的保护范围
。