生物工程真皮乳头和毛囊以及相关产品、方法和应用

发明领域所公开的发明一般为生物工程组织领域，并具体地生物工程毛囊组织领域。

背景技术：

0、发明背景

1、毛囊(hf)是一种复杂的“微器官”，由多种类型的细胞组成，包括上皮细胞、间充质细胞和神经嵴细胞。hf中的一个间充质细胞群——真皮乳头(dp)细胞——被认为对于hf形成和出生后毛发生长期间诱导上皮细胞至关重要(driskell等人,2011)。上皮和间充质起源细胞之间在空间和时间上的适当通讯和相互作用导致了在发育、生长和创伤修复期间毛发的生成、维持和更新。在hf发育的早期阶段期间，dp形成为间充质凝聚物，该间充质凝聚物收缩为细胞小球，落至毛囊基部，并在整个毛发生长期保持嵌入。dp通过表达涉及wnt、fgf、头蛋白和shh的信号传导分子而继续向上皮区室发出信号，从而促进hf形成、再生和后续毛发生长(ohyama等人,2010；reddy等人,2001)。

2、尽管在出生后没有新的毛囊形成，但毛囊下部终生保持从再生(毛发生长初期(anagen))、退化(毛发生长中期(catagen))到静止(毛发生长静止期(telogen))的周期性生长，以生成新的毛干。然而，由内部或外部触发引起的hf逐渐小型化将导致毛发生长初期缩短以及毛发数量减少，并最终发展为脱发(premanand&reena rajkumari,2018)。

3、毛发不仅具有有用的生物功能，如防止有害要素以及分散汗腺产物，而且在我们的社会中也具有社会心理重要性。虽然脱发本身并不危及生命，但受影响的个体却始终经历巨大的心理情绪压力，并可能具有心理和/或精神问题如焦虑、苦恼和抑郁，这显著损害了他们的生活质量(aghaei等人,2014；cartwright等人,2009；gokalp,2017；hunt&mchale,2005；williamson等人,2001)。

4、已经开发出多种脱发治疗法，包括药物、植物提取物以及光疗，但大多数目前的秃发治疗法远不能令人满意——带来相当大的副作用或者具有有限且暂时的效应，主要是针对具有轻度秃发症状的患者(sadick等人,2017)。手术治疗使用从安全头皮区收采的小块毛囊进行自体毛发移植。然而，移植的成功依赖于足够的供体供应，其中供体hf的有限可得性是瓶颈之一，更不用说痛苦的收采规程、劳动密集性，以及规程的较高成本。

5、现有治疗法的局限性驱使寻求更好的治疗替代方案来解决这种尚未满足的医疗需求，其中基于干细胞的组织工程学正在成为一种有前景性的方法。尽管使用鼠毛囊真皮乳头细胞与上皮细胞联合在鼠皮肤中从头毛发再生已展示取得成功，但人毛囊的重建却尚未成功(castro&logarinho,2020)。由于复杂的三维组织和多种信号传导相互作用，对于生成重现关键的毛发特异性标记和毛发诱导潜能的生物工程人毛囊的尝试一直很困难。用于建立生理相关的工程毛囊的挑战包括人毛囊细胞表型的维持、掺入不同微环境因子的限定培养条件的开发，以及能够实现有效的上皮-间充质相互作用并模拟人毛囊三维构型的适当结构设计。

6、因此，本发明的一个目的是提供制备生物工程毛囊的方法。

7、本发明的另一个目的是提供生物工程毛囊。

8、本发明的另一个目的是提供在体外使用生物工程毛囊的方法。

9、本发明的另一个目的是提供在体内使用生物工程毛囊的方法。

10、本发明的另一个目的是提供使用生物工程毛囊来鉴定用于治疗天然毛囊和脱发的药物和疗法的方法。

11、对已包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、文章等的任何讨论均不应视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分，或者是在本技术的每项权利要求的优先权日之前就存在的本公开有关的领域中的公知常识。

技术实现思路

1、公开了组合物和方法，该组合物和方法涉及由间充质细胞和细胞外基质构成的微球、此类微球的含角质形成细胞形式，以及由此类微球产生的生物工程毛囊。已发现，通过平衡间充质细胞-基质混合物中的间充质细胞和细胞外基质的比例，并且通过孵育特定范围的小体积的间充质细胞-基质混合物，可以形成具有有用特性的间充质细胞-基质微球。最显著地，所得的间充质细胞-基质微球特别适合用于产生具有天然毛囊特征的生物工程毛囊。

2、公开了产生生物工程毛囊的方法，该方法包括：

3、通过将间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴分配到容器中并且孵育该液滴而形成包含间充质细胞和细胞外基质的微球，由此形成间充质细胞-基质微球；

4、在补充因子的存在下，在容器中培养间充质细胞-基质微球；

5、在靠近间充质细胞-基质微球之处，将上皮细胞的悬浮物的液滴分配到容器中以形成间充质微球-上皮细胞混合物，并且培养间充质微球-上皮细胞混合物；以及

6、将容器中的培养基更换为表皮化培养基并且培养，由此产生生物工程毛囊。

7、在一些形式中，并且更具体地，该方法可以包括通过将间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴分配到容器中并且在25℃至39℃、35℃至39℃，或优选地37℃的温度下任选地具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中，在培养容器中孵育液滴1小时至100小时、5小时至50小时，或优选地8小时至30小时，来形成包含间充质细胞和细胞外基质的微球，由此形成间充质细胞-基质微球；

8、在补充因子的存在下，在容器中培养间充质细胞-基质微球；

9、在靠近间充质细胞-基质微球之处，将上皮细胞的悬浮物的液滴分配到容器中以形成间充质微球-上皮细胞混合物，并且培养间充质微球-上皮细胞混合物；以及

10、将容器中的培养基更换为表皮化培养基，并且在35℃至39℃下任选地具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中培养1至20天，或优选地3至10天，由此产生生物工程毛囊。

11、在一些形式中，间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴具有范围为0.5至10.0μl、1.0至5.0μl，或优选地2.0至3.0μl的体积。在一些形式中，间充质细胞和细胞外基质的悬浮物包含密度为1x 104至1x 107个细胞/ml，或优选地1x 105至1x 106个细胞/ml的间充质细胞，以及浓度为0.01mg/ml至2.0mg/ml，或优选地0.05mg/ml至0.5mg/ml的细胞外基质。

12、在一些形式中，间充质细胞是人真皮乳头细胞(dpc)、人间充质干细胞、人成纤维细胞或其组合。在一些形式中，细胞外基质包含胶原、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、糖胺聚糖、玻连蛋白或其组合。在一些形式中，细胞外基质包含胶原或基本上由胶原组成。

13、在一些形式中，培养容器包含在培养平台中，其中培养平台为384孔培养板、定制88孔微孔或基于pdms的微孔。在一些形式中，补充因子包含fgf、hgf、wnt、bmp、pdgf或其组合。

14、在一些形式中，将间充质细胞-基质微球在25℃至39℃，优选地37℃下在具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中在补充因子存在下在容器中培养1至100小时，优选地12小时至30小时。

15、在一些形式中，上皮细胞的悬浮物的液滴具有范围为0.5至10.0μl、1.0至5.0μl，或优选地2.0至3.0μl的体积，并且优选地悬浮物含有密度为1x 104至1x 107个细胞/ml，或优选地1x 105至1x 106个细胞/ml的上皮细胞。在一些形式中，将间充质微球-上皮细胞混合物在35℃至39℃下在具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中培养1小时至100小时、5小时至50小时，或优选地18小时至30小时。在一些形式中，上皮细胞是人表皮角质形成细胞、人毛囊角质形成细胞、人表皮祖细胞、人ipsc衍生的上皮细胞或其组合。

16、在一些形式中，所有的孵育和培养均在37℃下具有5％ co2的湿润气氛中执行。在一些形式中，将间充质细胞和细胞外基质的液滴孵育过夜，其中将间充质细胞-基质微球培养过夜，并且其中将间充质细胞微球-上皮细胞混合物培养过夜。在一些形式中，将间充质细胞微球-上皮细胞混合物在表皮化培养基中培养8天。

17、在一些形式中，间充质细胞和基质的液滴含有约500至约10000个细胞、约1000至约5000个细胞或约1000至约3000个细胞，或优选地约1250个间充质细胞。在一些形式中，间充质细胞微球-上皮细胞混合物含有至少一种或一种间充质细胞-基质微球，以及约500至约10000、约1000至约5000或约1000至约3000，或优选地约1250个上皮细胞。在一些形式中，在形成微球之前，间充质细胞以单层培养来培养不超过20代，优选地5代。

18、在一些形式中，间充质细胞-基质微球具有指示其毛发诱导性的一种或多种特征。在一些形式中，指示间充质细胞-基质微球的毛发诱导性的一种或多种特征包括碱性磷酸酶的表达、多能蛋白聚糖的表达、纤连蛋白的表达、wnt信号传导途径的激活、bmp信号传导途径的激活或其组合。在一些形式中，生物工程毛囊具有指示毛发诱导性的一种或多种特征。在一些形式中，指示生物工程毛囊的毛发诱导性的一种或多种特征包括碱性磷酸酶的表达、纤连蛋白的表达或其组合。

19、在一些形式中，生物工程毛囊具有指示上皮细胞增殖的一种或多种特征。在一些形式中，指示上皮细胞增殖的一种或多种特征包括细胞角蛋白的表达、整合素α6的表达或其组合。在一些形式中，生物工程毛囊具有指示毛发分化的一种或多种特征。在一些形式中，指示毛发分化的一种或多种特征包括角蛋白75的表达。

20、在一些形式中，生物工程毛囊中的细胞具有细胞-细胞接触以及细胞-细胞外基质接触两者。在一些形式中，间充质细胞-基质微球中的大多数间充质细胞并未包裹在基质中，使得它们不接触另外的间充质细胞。在一些形式中，间充质细胞-基质微球中的大多数间充质细胞具有细胞-细胞接触以及细胞-细胞外基质接触两者。

21、在一些形式中，间充质细胞-基质微球包含形态上类似于天然真皮乳头结构的球形结构。在一些形式中，球形结构具有范围为50至2000μm、100至500μm、50至500μm，或优选地200至250μm的直径。在一些形式中，生物工程毛囊包含形态上类似于天然毛囊的管状结构。在一些形式中，管状结构具有范围为50至500μm，或优选地100至250μm的直径，以及范围为100至2000μm，或优选地200至1000μm的长度。

22、在一些形式中，将间充质细胞-基质微球在不存在任何其他间充质细胞-基质微球的情况下在同一容器中培养。在一些形式中，培养间充质细胞-基质微球的容器是多孔板中的单个孔。在一些形式中，在培养间充质细胞-基质微球的同时，将其他间充质细胞-基质微球各自在多孔板的不同的其他孔中进行培养。在一些形式中，间充质细胞-基质微球在培养期间不从容器中移除，直到产生生物工程毛囊。

23、还公开了通过本文所公开的任何方法所产生的生物工程毛囊。

24、还公开了使用所公开的生物工程毛囊的方法。在一些形式中，该方法包括使生物工程毛囊与测试化合物接触，对生物工程毛囊的特征进行测量，将所测量的特征与在未与测试化合物接触的对照生物工程毛囊中测量的相同特征进行比较，其中所测量的特征的差异指示出测试化合物影响生物工程毛囊的所测量的特征。

25、在一些形式中，所测量的特征是毛囊生长，其中测量的毛囊生长的差异指示出测试化合物影响毛囊生长。

26、还公开了使用所公开的生物工程毛囊来预防性或治疗性治疗毛发减少状态的方法。

27、还公开了使用所公开的生物工程毛囊来治疗秃发的方法。

28、本发明的优选的实施方案如下。

29、1.产生生物工程毛囊的方法，所述方法包括：

30、通过将间充质细胞和细胞外基质的悬浮物的液滴分配到容器中并且在培养容器中孵育所述液滴而形成包含间充质细胞和细胞外基质的微球，由此形成间充质细胞-基质微球；

31、在补充因子的存在下，在所述容器中培养所述间充质细胞-基质微球；

32、在靠近所述间充质细胞-基质微球之处，将上皮细胞的悬浮物的液滴分配到所述容器中以形成间充质微球-上皮细胞混合物，并且培养所述间充质微球-上皮细胞混合物；以及

33、将所述容器中的培养基更换为表皮化培养基并且培养，由此产生生物工程毛囊。

34、2.根据实施方案1所述的方法，其中所述间充质细胞和细胞外基质的所述悬浮物的所述液滴具有范围为0.5至10.0μl、1.0至5.0μl，或优选地2.0至3.0μl的体积。

35、3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述间充质细胞和细胞外基质的所述悬浮物包含密度为1x 104至1x 107个细胞/ml的所述间充质细胞，以及浓度为0.01mg/ml至3.0mg/ml或0.01mg/ml至2.0mg/ml，优选地0.05mg/ml至0.5mg/ml的细胞外基质。

36、4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞是人真皮乳头细胞(dpc)、人间充质干细胞、人成纤维细胞或其组合。

37、5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含胶原、纤连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、糖胺聚糖、玻连蛋白或其组合。

38、6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质包含胶原或基本上由胶原组成。

39、7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中所述培养容器包含384孔培养板、定制88孔微孔或基于pdms的微孔。

40、8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中所述补充因子包含fgf、hgf、wnt、bmp、pdgf或其组合。

41、9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞-基质微球在25℃至39℃，优选地37℃下在具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中在补充因子存在下在所述容器中培养1至100小时，优选地12小时至30小时。

42、10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞的所述悬浮物的所述液滴具有范围为0.5至10.0μl、1.0至5.0μl，或优选地2.0至3.0μl的体积，并且优选地所述悬浮物含有密度为1x 104至1x 107个细胞/ml，或优选地1x 105至1x 106个细胞/ml的所述上皮细胞。

43、11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中将所述间充质微球-上皮细胞混合物在35℃至39℃下具有3.5％至6％ co2的湿润气氛中培养1小时至100小时、5小时至50小时，或优选地18小时至30小时。

44、12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述上皮细胞是人表皮角质形成细胞、人毛囊角质形成细胞、人表皮祖细胞或干细胞、人ipsc衍生的上皮细胞或其组合。

45、13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中间充质细胞与上皮细胞的比率为0.1:1至10:1，优选地1:1；

46、优选地，其中所述间充质细胞是人真皮乳头细胞(dpc)，并且所述上皮细胞是人表皮角质形成细胞，并且dpc与角质形成细胞的比率为0.1:1至10:1，优选地1:1。

47、14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞和细胞外基质的所述液滴孵育过夜，其中将所述间充质细胞-基质微球培养过夜，并且其中将所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物培养过夜。

48、15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物在表皮化培养基中培养8天。

49、16.根据实施方案1至15中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞和基质的所述液滴含有约500至约10000个细胞、约1000至约5000个细胞或约1000至约3000个细胞，或优选地约1250个间充质细胞。

50、17.根据实施方案1至16中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞微球-上皮细胞混合物含有至少一种或一种间充质细胞-基质微球，以及约500至约10000、约1000至约5000或约1000至约3000，或优选地约1250个上皮细胞。

51、18.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞-基质微球具有指示其毛发诱导性的一种或多种特征，优选地指示所述间充质细胞-基质微球的所述毛发诱导性的所述一种或多种特征包括碱性磷酸酶的表达、多能蛋白聚糖的表达、纤连蛋白的表达、wnt信号传导途径的激活、bmp信号传导途径的激活或其组合。

52、19.根据实施方案1至18中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊具有指示毛发诱导性的一种或多种特征，优选地指示所述生物工程毛囊的毛发诱导性的所述一种或多种特征包括碱性磷酸酶的表达、纤连蛋白的表达或其组合。

53、20.根据实施方案1至19中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊具有指示上皮细胞增殖的一种或多种特征，优选地指示上皮细胞增殖的所述一种或多种特征包括细胞角蛋白的表达、整合素α6的表达或其组合。

54、21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊具有指示毛发分化的一种或多种特征，优选地指示毛发分化的所述一种或多种特征包括角蛋白75的表达。

55、22.根据实施方案1至21中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊中的所述细胞具有细胞-细胞接触以及细胞-细胞外基质接触两者。

56、23.根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中所述间充质细胞-基质微球包含形态上类似于天然真皮乳头结构的球形结构。

57、24.根据实施方案23所述的方法，其中所述球形结构具有范围为50至2000μm的直径。

58、25.根据实施方案1至22中任一项所述的方法，其中所述生物工程毛囊包含形态上类似于天然毛囊的管状结构。

59、26.根据实施方案1至25中任一项所述的方法，其中将所述间充质细胞-基质微球在不存在任何其他间充质细胞-基质微球的情况下在同一容器中，或者在多孔板的单个孔中培养。

60、27.通过根据实施方案1至26中任一项所述的方法产生的生物工程毛囊。

61、28.使用根据实施方案27所述的生物工程毛囊的方法，所述方法包括：

62、使所述生物工程毛囊与测试化合物接触，对所述生物工程毛囊的特征进行测量，将所述测量的特征与在未与所述测试化合物接触的对照生物工程毛囊中测量的相同特征进行比较，其中所述测量的特征的差异指示出所述测试化合物影响所述生物工程毛囊的所述测量的特征。

63、29.根据实施方案28所述的方法，其中所述测量的特征是毛囊生长，其中所述测量的毛囊生长的差异指示出所述测试化合物影响毛囊生长。

64、30.使用根据实施方案27所述的生物工程毛囊来预防性或治疗性治疗毛发减少状态的方法。

65、31.使用根据实施方案27所述的生物工程毛囊来治疗秃发的方法。

66、所公开的方法和组合物的额外优势部分地在以下描述中阐述，并且部分地从描述中理解，或者可以通过所公开的方法和组合物的实践而获知。所公开的方法和组合物的优势将通过特别地在所附权利要求书中指出的元素和组合而被理解和达到。应当理解，前述一般描述和下述详述都只是示例性的和说明性的，并且不限制所要求保护的本发明。