与艰难梭菌结合的抗体

本发明涉及与艰难梭菌(clostridium difficile菌(c.difficile菌))结合的抗体及其抗原结合片段以及它们的应用。

背景技术：

1、肠道内对生物体来说相当于“体外”，因此处于总是暴露于种类繁多且大量的肠内常驻细菌、病毒、食物来源等的抗原下的状态。这样的肠内常驻细菌形成了肠内菌群。

2、已知该肠内菌群通过由肠上皮细胞等构成的粘膜面对生物体发挥出各种功能，还已知当不存在肠内细菌时，肠道免疫系统不能正常发展(非专利文献1～3)。

3、若肠内菌群发生变化、与宿主的共生关系被破坏，则肠道免疫系统会被过度刺激而破坏其稳态性，进而诱发炎症性肠病、大肠癌、哮喘、过敏、肥胖等多种疾病。由此可知，肠道免疫系统不仅对病原体等的消除起到重要作用，而且对免疫系统整体的稳态性的维持也起到重要作用(非专利文献4～7)。

4、以往已经进行了很多使用抗生素来控制肠内菌群的尝试，但作为问题，仍可举出由于抗生素抗性菌的问题而不再起效的情况。因此，尽管进行了以往的尝试，但仍有许多患者承受艰难梭菌肠炎或其他与肠内菌群相关的炎症性肠病的折磨。另外，虽然已经尝试了粪便移植等作为比较新颖的方法，但其治疗效果并不稳定。其结果，在一些尝试中，作为治疗方法的开发已经停止。另外，以往研究了将针对肠内菌群释放的毒素的抗体用作治疗药并已实现了商品化。但是，该抗体药物只是针对毒素的药物，因此使用该抗体药物的治疗法只是对症疗法。因此，希望开发出用于从根本上治疗与肠内菌群相关的炎症性肠病的药物。

5、与炎症性肠病相关的艰难梭菌作为引起院内感染的细菌，与mrsa均是需要注意的细菌。实际上，根据美国的统计，每年有40～50万人左右感染，15000～20000人左右死亡。艰难梭菌感染多数情况下发生于长期给予抗生素的患者，且是一旦患病则复发的概率高达15-35％的疾病，从这方面出发，在与炎症性肠病相关的细菌中，也要求特别有效的治疗。目前进行了利用万古霉素等强效抗生素的治疗，但其原本就会残留细菌毒素、并助长具有抗生素抗性的细菌的产生，因此正在寻求替代方法。

6、现有技术文献

7、非专利文献

8、非专利文献1：cerf-bensussan n,and gaboriau-routhiau v.,nat rev immunol2010；10:735

9、非专利文献2：hooper lv,and macpherson aj.,nat rev immunol 2010；10:159

10、非专利文献3：round jl,and mazmanian sk,proc natl acad sci usa 2010；107:12204

11、非专利文献4：vijay-kumar m,et al.,science 2010；328:228

12、非专利文献5：shulzhenko n,et al.,nat med 2011；17:1585

13、非专利文献6：bry l,et al.,science 1996；273:1380

14、非专利文献7：turnbaugh pj,et al.,nature 2006；444:1027

技术实现思路

1、发明所要解决的课题

2、本发明的课题在于，为了控制肠内菌群，提供一种与包含艰难梭菌(c.difficile)菌体的肠内细菌结合的抗体。

3、用于解决课题的手段

4、本发明的发明人进行了深入研究，结果发现了与肠内细菌、特别是艰难梭菌菌体及其他肠内细菌的菌体结合的抗体。

5、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含下述重链可变区以及轻链可变区：

6、该重链可变区包含含有序列编号7所表示的氨基酸序列的重链可变区的重链cdr1的氨基酸序列、重链cdr2的氨基酸序列和重链cdr3的氨基酸序列，

7、该轻链可变区包含含有序列编号8所表示的氨基酸序列的轻链可变区的轻链cdr1的氨基酸序列、轻链cdr2的氨基酸序列和轻链cdr3的氨基酸序列。

8、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含下述重链可变区以及轻链可变区：

9、所述重链可变区包含含有序列编号17所表示的氨基酸序列的重链可变区的重链cdr1的氨基酸序列、重链cdr2的氨基酸序列和重链cdr3的氨基酸序列，

10、所述轻链可变区包含含有序列编号18所表示的氨基酸序列的轻链可变区的轻链cdr1的氨基酸序列、轻链cdr2的氨基酸序列和轻链cdr3的氨基酸序列。

11、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含下述重链可变区以及轻链可变区：

12、所述重链可变区包含含有序列编号27所表示的氨基酸序列的重链可变区的重链cdr1的氨基酸序列、重链cdr2的氨基酸序列和重链cdr3的氨基酸序列，

13、所述轻链可变区包含含有序列编号28所表示的氨基酸序列的轻链可变区的轻链cdr1的氨基酸序列、轻链cdr2的氨基酸序列和轻链cdr3的氨基酸序列。

14、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含下述重链可变区以及轻链可变区：

15、所述重链可变区包含含有序列编号1所表示的氨基酸序列的重链cdr1、

16、含有序列编号2所表示的氨基酸序列的重链cdr2、和

17、含有序列编号3所表示的氨基酸序列的重链cdr3，

18、所述轻链可变区包含含有序列编号4所表示的氨基酸序列的轻链cdr1、

19、含有序列编号5所表示的氨基酸序列的轻链cdr2、和

20、含有序列编号6所表示的氨基酸序列的轻链cdr3。

21、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含下述重链可变区以及轻链可变区：

22、所述重链可变区包含含有序列编号11所表示的氨基酸序列的重链cdr1、

23、含有序列编号12所表示的氨基酸序列的重链cdr2、和

24、含有序列编号13所表示的氨基酸序列的重链cdr3，

25、所述轻链可变区包含含有序列编号14所表示的氨基酸序列的轻链cdr1、

26、含有序列编号15所表示的氨基酸序列的轻链cdr2、和

27、含有序列编号16所表示的氨基酸序列的轻链cdr3。

28、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含下述重链可变区以及轻链可变区：

29、所述重链可变区包含含有序列编号21所表示的氨基酸序列的重链cdr1、

30、含有序列编号22所表示的氨基酸序列的重链cdr2、和

31、含有序列编号23所表示的氨基酸序列的重链cdr3，

32、所述轻链可变区包含含有序列编号24所表示的氨基酸序列的轻链cdr1、

33、含有序列编号25所表示的氨基酸序列的轻链cdr2、和

34、含有序列编号26所表示的氨基酸序列的轻链cdr3。

35、本发明的一个方式中提供一种抗体或其抗原结合片段，其中，

36、与包含含有序列编号37所表示的氨基酸序列的重链可变区、以及含有序列编号38所表示的氨基酸序列的轻链可变区的参照抗体相比，在选自重链cdr1～3、轻链cdr1～3和轻链fr1中的至少一个区具有至少一个氨基酸突变，

37、与大肠杆菌shmt蛋白中的氨基酸序列rqeehielias和艰难梭菌的ipgm蛋白中的氨基酸序列vldmmklekpe结合。

38、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含下述重链可变区以及轻链可变区，

39、所述重链可变区包含：

40、含有x1yyih的氨基酸序列的重链cdr1、

41、含有ridpenx2x3ttyapkfq的氨基酸序列的重链cdr2、和

42、含有ycarstvl的氨基酸序列的重链cdr3，

43、所述轻链可变区包含：

44、含有rx4sqsivhtng的氨基酸序列的轻链cdr1、

45、含有klliykv的氨基酸序列的轻链cdr2、和

46、含有gvyyfqgs的氨基酸序列的轻链cdr3，

47、轻链fr1包含：

48、tplslpvslgdqa的氨基酸序列、或

49、spasx5svslgdrx6的氨基酸序列，

50、x1、x2、x3各自独立地为中性极性氨基酸或酸性极性氨基酸，x4为非极性氨基酸或中性极性氨基酸，x5、x6各自独立地为非极性氨基酸，

51、该抗体不包括下述的抗体：x1为天冬氨酸、x2为天冬氨酸，x3为谷氨酸，x4为丙氨酸，并且轻链fr1包含序列tplslpvslgdqa。

52、本发明的一个方式中提供一种核酸，其编码与艰难梭菌菌体结合、包含上述重链可变区和轻链可变区的组合的抗体或其抗原结合片段。

53、本发明的一个方式中提供一种表达载体，其包含下述的核酸，该核酸编码与艰难梭菌菌体结合、包含上述重链可变区和轻链可变区的组合的抗体或其抗原结合片段。

54、本发明的一个方式中提供一种细胞，其包含下述的核酸或含有该核酸的表达载体，该核酸编码与艰难梭菌菌体结合、包含上述重链可变区和轻链可变区的组合的抗体或其抗原结合片段。

55、本发明的一个方式中提供一种药物组合物，其包含与艰难梭菌菌体结合、包含上述重链可变区和轻链可变区的组合的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体或添加物。

56、本发明的一个方式中提供一种抑制个体中的与炎症性肠病相关的艰难梭菌细菌的增殖的方法，其包括将有效量的上述药物组合物给药至上述个体。

57、本发明的一个方式中提供一种与艰难梭菌菌体结合的抗体的制造方法，其包括下述步骤：

58、1)将从肠道粘膜固有层或脾脏采集的b细胞与除此以外的种类的细胞混合来进行融合，制作杂交瘤的步骤；

59、2)对上述杂交瘤进行培养，确定出产生与艰难梭菌菌体结合的抗体的细胞的步骤；以及

60、3)从上述产生与艰难梭菌菌体结合的抗体的细胞回收抗体的步骤。

61、更具体地说，本发明提供下述方案。

62、[项目1]

63、一种与艰难梭菌菌体结合的抗体或其抗原结合片段，其是下述的抗体或其抗原结合片段：

64、a)

65、包含下述重链可变区以及轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，

66、所述重链可变区包含含有序列编号7所表示的氨基酸序列的重链可变区的重链cdr1的氨基酸序列、重链cdr2的氨基酸序列和重链cdr3的氨基酸序列，

67、所述轻链可变区包含含有序列编号8所表示的氨基酸序列的轻链可变区的轻链cdr1的氨基酸序列、轻链cdr2的氨基酸序列和轻链cdr3的氨基酸序列；

68、b)

69、包含下述重链可变区以及轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，

70、所述重链可变区包含含有序列编号17所表示的氨基酸序列的重链可变区的重链cdr1的氨基酸序列、重链cdr2的氨基酸序列和重链cdr3的氨基酸序列，

71、所述轻链可变区包含含有序列编号18所表示的氨基酸序列的轻链可变区的轻链cdr1的氨基酸序列、轻链cdr2的氨基酸序列和轻链cdr3的氨基酸序列；

72、c)

73、包含下述重链可变区以及轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，

74、所述重链可变区包含含有序列编号27所表示的氨基酸序列的重链可变区的重链cdr1的氨基酸序列、重链cdr2的氨基酸序列和重链cdr3的氨基酸序列，

75、所述轻链可变区包含含有序列编号28所表示的氨基酸序列的轻链可变区的轻链cdr1的氨基酸序列、轻链cdr2的氨基酸序列和轻链cdr3的氨基酸序列；或者

76、d)

77、下述的抗体或其抗原结合片段：

78、与包含含有序列编号37所表示的氨基酸序列的重链可变区、以及含有序列编号38所表示的氨基酸序列的轻链可变区的参照抗体相比，在选自重链cdr1～3、轻链cdr1～3和轻链fr1中的至少一个区具有至少一个氨基酸突变，

79、与大肠杆菌shmt蛋白中的氨基酸序列rqeehielias和艰难梭菌的ipgm蛋白中的氨基酸序列vldmmklekpe结合。

80、[项目2]

81、如项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，包含下述重链可变区以及轻链可变区：

82、包含含有序列编号1所表示的氨基酸序列的重链cdr1、

83、含有序列编号2所表示的氨基酸序列的重链cdr2、和

84、含有序列编号3所表示的氨基酸序列的重链cdr3的重链可变区、以及

85、包含含有序列编号4所表示的氨基酸序列的轻链cdr1、

86、含有序列编号5所表示的氨基酸序列的轻链cdr2、和

87、含有序列编号6所表示的氨基酸序列的轻链cdr3

88、的轻链可变区；

89、包含含有序列编号11所表示的氨基酸序列的重链cdr1、

90、含有序列编号12所表示的氨基酸序列的重链cdr2、和

91、含有序列编号13所表示的氨基酸序列的重链cdr3

92、的重链可变区、以及

93、包含含有序列编号14所表示的氨基酸序列的轻链cdr1、

94、含有序列编号15所表示的氨基酸序列的轻链cdr2、和

95、含有序列编号16所表示的氨基酸序列的轻链cdr3

96、的轻链可变区；或者

97、包含含有序列编号21所表示的氨基酸序列的重链cdr1、

98、含有序列编号22所表示的氨基酸序列的重链cdr2、和

99、含有序列编号23所表示的氨基酸序列的重链cdr3

100、的重链可变区、以及

101、包含含有序列编号24所表示的氨基酸序列的轻链cdr1、

102、含有序列编号25所表示的氨基酸序列的轻链cdr2、和

103、含有序列编号26所表示的氨基酸序列的轻链cdr3

104、的轻链可变区。

105、[项目3]

106、如项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，包含下述重链可变区以及轻链可变区，

107、所述重链可变区含有与序列编号7所表示的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性的序列，

108、所述轻链可变区含有与序列编号8所表示的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性的序列。

109、[项目4]

110、如项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，包含下述重链可变区以及轻链可变区，

111、所述重链可变区含有与序列编号17所表示的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性的序列，

112、所述轻链可变区含有与序列编号18所表示的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性的序列。

113、[项目5]

114、如项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，包含下述重链可变区以及轻链可变区，

115、所述重链可变区含有与序列编号27所表示的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性的序列，

116、所述轻链可变区含有与序列编号28所表示的氨基酸序列具有至少90％的序列一致性的序列。

117、[项目6]

118、如项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，包含下述重链可变区以及轻链可变区，

119、所述重链可变区包含：

120、含有x1yyih的氨基酸序列的重链cdr1、

121、含有ridpenx2x3ttyapkfq的氨基酸序列的重链cdr2、和

122、含有ycarstvl的氨基酸序列的重链cdr3，

123、所述轻链可变区包含：

124、含有rx4sqsivhtng的氨基酸序列的轻链cdr1、

125、含有klliykv的氨基酸序列的轻链cdr2、

126、含有gvyyfqgs的氨基酸序列的轻链cdr3，

127、轻链fr1包含：

128、tplslpvslgdqa的氨基酸序列、或

129、spasx5svslgdrx6的氨基酸序列，

130、x1、x2、x3各自独立地为中性极性氨基酸或酸性极性氨基酸，x4为非极性氨基酸或中性极性氨基酸，x5、x6各自独立地为非极性氨基酸，

131、该抗体不包括下述的抗体：x1为天冬氨酸，x2为天冬氨酸，x3为谷氨酸，x4为丙氨酸，并且轻链fr1包含序列tplslpvslgdqa。

132、[项目7]

133、如项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，包含下述重链可变区以及轻链可变区，

134、所述重链可变区包含：

135、含有x1yyih的氨基酸序列的重链cdr1、

136、含有ridpenx2x3ttyapkfq的氨基酸序列的重链cdr2、和

137、含有ycarstvl的氨基酸序列的重链cdr3，

138、所述轻链可变区包含：

139、含有rx4sqsivhtng的氨基酸序列的轻链cdr1、

140、含有klliykv的氨基酸序列的轻链cdr2、和

141、含有gvyyfqgs的氨基酸序列的轻链cdr3，

142、轻链fr1包含：

143、tplslpvslgdqa的氨基酸序列、或

144、spasx5svslgdrx6的氨基酸序列，

145、x1、x2各自独立地为天冬酰胺或天冬氨酸，x3为谷氨酰胺或谷氨酸，x4为丙氨酸或丝氨酸，x5为亮氨酸或蛋氨酸，x6为丙氨酸或缬氨酸，

146、该抗体不包括下述的抗体：x1为天冬氨酸，x2为天冬氨酸，x3为谷氨酸，并且轻链fr1包含序列tplslpvslgdqasiscra。

147、[项目8]

148、如项目1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，包含下述重链可变区以及轻链可变区，

149、所述重链可变区包含：

150、含有序列编号31或41所表示的氨基酸序列的重链cdr1、

151、含有序列编号32、42～44中任一者所表示的氨基酸序列的重链cdr2、和

152、含有序列编号33所表示的氨基酸序列的重链cdr3；

153、所述轻链可变区包含：

154、含有序列编号34或52所表示的氨基酸序列的轻链cdr1、

155、含有序列编号35所表示的氨基酸序列的轻链cdr2、和

156、含有序列编号36所表示的氨基酸序列的轻链cdr3、以及

157、含有序列编号53～56中任一者所表示的氨基酸序列的轻链fr1，

158、该抗体不包括：包含含有序列编号37所表示的氨基酸序列的重链可变区、以及含有序列编号38所表示的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

159、[项目9]

160、一种核酸，其编码项目1～8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

161、[项目10]

162、一种表达载体，其包含项目9所述的核酸。

163、[项目11]

164、一种细胞，其包含项目9所述的核酸、或者项目10所述的表达载体。

165、[项目12]

166、一种药物组合物，其包含项目1～8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载体或添加物。

167、[项目13]

168、如项目12所述的药物组合物，其为冷冻干燥状态。

169、[项目14]

170、一种与艰难梭菌菌体结合的抗体的制造方法，其包括下述步骤：

171、1)由从肠道粘膜固有层或脾脏采集的b细胞制作抗体产生性永生化细胞的步骤；

172、2)对上述抗体产生性永生化细胞进行培养，确定出产生与艰难梭菌菌体结合的抗体的细胞的步骤；以及

173、3)从上述产生与艰难梭菌菌体结合的抗体的细胞回收抗体的步骤。

174、[项目15]

175、如项目14所述的与艰难梭菌菌体结合的抗体的制造方法，其中，上述步骤2通过确定出产生与固定于载体的菌体结合的抗体的细胞来进行。

176、发明的效果

177、本发明发挥出下述效果：提供与肠内细菌、特别是艰难梭菌菌体及其他肠内细菌的菌体结合的抗体及其抗原结合片段以及其应用。