用于空间条形码编码和测序的UNIT-DNA组合物的制作方法

本发明涉及空间测序技术。目的是确定mrna在组织区域或组织内单个细胞中的分布。

背景技术：

1、空间测序是允许在组织环境中直接对细胞的mrna内容进行测序的方法的统称。这些方法一方面可以用于在高度多重荧光原位杂交(fish)测定中分析细胞的mrna表达谱。

2、另一方面，原位测序还可以使用特定mrna结合探针读出mrna序列信息，该探针可以占据特定mrna或cdna序列的预定义部分的副本(“缺口填充挂锁探针(gap-fill padlockprobe)”，ke等人，nature methods 2013，doi:10.1038/nmeth.2563)。最近还发表了原位基因组测序(igs)方法(in situ genom e sequencing resolves dna sequence andstructure in intact biological samples”，ac payne等人，science 10.1126/science.aay3446(2020))。所有原位测序方法都需要信号放大步骤，该信号放大步骤在大多数情况下通过mrna或cdna结合探针的环化或通过发夹连接gdna插入物环化和随后的滚环扩增(rca)来进行，从而产生含探针和/或靶序列的多个拷贝的dna分子，即所谓的纳米球、圆形克隆(rolony)或滚环扩增产物(rcp)。由于这些是纳米或微米级大小的大分子，因此一个细胞内可以形成的圆形克隆的数量严格受到该细胞大小的限制。

3、此外，如果细胞内圆形克隆的密度太高，则在测序过程的光学检测步骤期间对单个mrna信号的辨别力被严重削弱。由于这是该技术的主要缺点，因此已经开发了各种技术来规避这一点，例如设计更小的圆形克隆或生成和清除组织-水凝胶复合物(asp等人，bioessays 2020，doi：10.1002/bies.201900221)或者扩展细胞靶标，称为扩展测序(alon等人，science 371，eaax2656(2021))。

4、然而，这些方法仍然没有完全规避原位测序固有的空间限制。另一种方法避免了原位信号放大：原位捕获依赖于将mrna分子从组织转移到涂有条形码引物斑点的表面上，从而允许将非原位获得的序列信息回溯到从中提取测序mrna的特定组织区域。然而，该方法也受到限制，这是因为由于条形码捕获斑点的尺寸相对较大，rna捕获效率受到限制并且分辨率较差(无单细胞分析)(asp等人，bioessays 2020，doi:10.1002/bies.201900221)。

技术实现思路

1、本发明涉及一种使用光学方法将条形码插入多核苷酸(优选dna序列)的方法。该代码可用于检索执行编码的位置。本文的目的是在很大程度上克服现有原位测序方法在原位可测量的mrna序列数量以及表达动力学方面的局限性。光学编码可以具有1μm范围内的分辨率和足以使每个细胞在典型尺寸的组织切片中接收其自己代码的代码可变性。所提出的编码和解码工作流程如图1所示。

2、本文公开的基本原理是基于通过通用模板指导的dna合成对核酸进行空间条形码编码。该方法随后将被称为unit-dna(universal template dna，通用模板dna)。

3、因此，本发明的目的是一种提供多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含具有条形码核苷酸序列的第一链和第二链，其特征在于，第一链在其5’末端具有至少一个通用碱基的突出端，并且所述多核苷酸的第二链的相应凹陷3’末端具有至少一个带有封闭基团的核苷酸，其中将封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。

4、封闭基团的去除可以通过为封闭基团提供合适的可光裂解单元或通过添加由光照射而活化的或以其活性形式提供的裂解试剂来完成。

5、在该方法的第一变体中，通过提供裂解试剂通过光照射从掺入的核苷酸中去除封闭基团，其中裂解试剂是通过用光照射裂解试剂的前体来提供的。

6、在该方法的第二变体中，其中核苷酸具有可光裂解的封闭基团，将该封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。此类试剂是已知的，例如“cy5-tec p”，其通过用光照射而裂解成活性裂解试剂“cy5”。

7、在下文中，术语“多核苷酸”是指双链核酸，如dna、rna、dna-rn a、c-dna、ssdna和类似物，例如pna或lna。

技术特征：

1.一种提供多核苷酸的方法，所述多核苷酸包含具有条形码核苷酸序列的第一链和第二链，其特征在于，所述第一链在其5’末端具有至少一个通用碱基的突出端，并且所述多核苷酸的所述第二链的相应凹陷3’末端具有至少一个带有封闭基团的核苷酸，其中将所述封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过提供裂解试剂通过光照射从掺入的核苷酸中去除所述封闭基团，其中所述裂解试剂是通过用光照射所述裂解试剂的前体来提供的。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，其中所述核苷酸具有可光裂解的封闭基团，将该封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一链在其3’末端进一步具有封闭基团。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一链的所述突出端在其5’末端具有第一寡核苷酸。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸直接或通过寡核苷酸桥与所述第一链的3’末端连接，从而形成环。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸链。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸，其中所述平末端直接或通过寡核苷酸桥彼此连接。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸，其中所述第一寡核苷酸直接或通过寡核苷酸桥与所述第一链的3’末端连接，从而形成环，并且杂交的相应核苷酸的3’末端含有不可裂解的封闭基团。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸与相应的核苷酸杂交，从而获得了具有平末端和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口的多核苷酸链，其中杂交的相应核苷酸的3’末端直接或通过寡核苷酸桥与所述第二链的5’末端连接，从而形成环，所述第一链的3’末端含有不可裂解的封闭基团。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸链是通过mrna链的模板转换提供的，是以下步骤的结果：a)通过寡核苷酸dt引物逆转录mrna来合成第一链，导致3’末端的c核苷酸添加至捕获的靶序列，然后b)模板转换寡核苷酸与3’末端的相应g核苷酸杂交，产生模板转换的cdna，c)将上述模板转换的cdna与相应的第一链核苷酸杂交，产生游离的3’oh和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述dna链是由产生环状ssdna模板的挂锁工作流程提供的，是以下步骤的结果：a)作为挂锁探针杂交(包括用于缺口填充挂锁探针的缺口填充反应)和连接的结果，具有捕获的靶序列的环状ssdna；b)寡核苷酸与环状ssdna杂交，以允许dsdn a限制，产生线性ssdna，c)将上述线性ssdna与相应的第一链核苷酸杂交，产生游离的3’oh和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述dna链是通过靶向dna扩增来提供的，是以下步骤的结果：a)dna片段化和衔接子连接；b)通过使用基因特异性引物(具有pcr柄)和通用引物的pcr来富集连接的靶序列，产生线性ssdna，c)将上述线性ssdna与相应的第一链核苷酸杂交，产生游离的3’oh和在所述至少一个通用碱基位置处的缺口。

技术总结
本发明涉及一种提供多核苷酸分子的方法，所述多核苷酸分子包含具有条形码核苷酸序列的第一链和第二链，其特征在于，所述第一链在其5’末端具有至少一个通用碱基的突出端，所述多核苷酸的第二链的相应的凹陷3’末端具有至少一个带有封闭基团的核苷酸，其中将所述封闭基团通过光照射从掺入的核苷酸中去除。

技术研发人员：R·托马斯,B·安德里亚斯,P·罗伯特,P·米歇尔,H·桑德拉,W·马蒂亚斯·伯纳德
受保护的技术使用者：美天施生物科技有限两合公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/29