用于确定氧化灭菌过程功效的生物指示器和使用方法与流程

发明领域本发明涉及适合于确定氧化灭菌过程，例如使用过氧化氢的灭菌过程的结果的生物指示器。

背景技术：

0、发明背景

1、灭菌过程的目的是提供不含可存活生命形式的表面或物体(例如实验室或医疗设备、仪器或器具)。此类过程广泛用于像医疗行业或广泛的科学研究活动的环境中。

2、此类过程的核心方面是确定灭菌过程是否成功的能力，以确保使用灭菌材料和/或表面所需的条件。为此，采用了不同质量程度的几种方法。

3、本领域已知的生物指示器通常涉及使已知量的微生物孢子(例如细菌孢子)与目标材料和/或表面一起经历灭菌过程。该过程完成后，立即进行测试以探测剩余活的和/或可存活的微生物的存在。如果这些测试产生阴性结果，则可以确定灭菌是有效的。

4、更具体的生物指示器包括探测某些生化反应的发生，已知所述生化反应表明存在可存活生命形式。这种生化反应涉及微生物生命中常见的酶和/或催化活性或染料的颜色变化。

5、专利申请us 2015/0159192 a1公开了确定灭菌过程成功的方法，所述方法包括使用分离的酶或这种酶对其是内源的或通过遗传改造表达的微生物。根据本公开的指示剂酶是常见于孢子形成微生物中的酶，例如β-d-葡糖苷酶。指示剂暴露于灭菌过程后，进行酶活性测试以评估灭菌的有效性。

6、其他生物指示器基于使用能够表达特定报告基因的遗传改造的微生物。

7、专利申请wo 2018/071732 a1公开了这样的生物指示器，其利用能够表达适合于筛选荧光的报告基因(例如适合于表达荧光蛋白的报告基因)的遗传改造的微生物。指示剂经过灭菌过程后，筛选其光学可检测信号，从而证明可存活微生物的存在或缺失。

8、类似地，专利申请wo 2017/185738 a1公开了基于使用来自表达特定荧光报告基因的遗传改造微生物的孢子的生物指示器。灭菌过程后，筛选指示剂的光学可检测信号，以评估可存活微生物的存在。

9、现有技术中已知的其他生物指示器包含提供适合表达具体酶的遗传改造微生物，以筛选所述具体酶在灭菌后的酶活性。

10、专利申请us 2017/0292143 a1公开了适合表达具体酶(例如β-内酰胺酶)的遗传改造微生物，所述酶能够水解被设计为通过水解发射荧光的荧光化合物。因此，光学可检测的荧光信号表明可存活微生物的存在。

11、其他生物指示器采用筛选替代蛋白，所述替代蛋白选自对传染原生长至关重要的蛋白以及致病性或免疫原性蛋白。

12、专利申请us 2017/0283847 a1公开了在灭菌过程后基于筛选确定的替代蛋白的生物指示器。所公开的方法需要程序例如蛋白质印迹分析以评估目标蛋白的存在。

13、相似特征的其他生物指示器也采用遗传修饰的微生物或突变体和/或标记的蛋白质和/或酶，以便能够在灭菌后进行有效的筛选，例如ca 2667698 c、us 9717812 b2、ep2456882 b1、us 10047334 b2、us 20140370535 a1和jp 2014-060947 a所公开的。

14、现有技术的生物指示器通常依赖于复杂、昂贵且显著耗时的生产和使用程序，从而影响生物指示器本身和一般灭菌过程的总成本。基于此类程序的生物指示器需要相当多的温育和/或读出时间，这也代表了时间和资源的大量支出。仅仅依赖于筛选酶活性的生物指示器受到所用酶的稳定性普遍较低的限制。酶的固有特征，像其结构和催化活性，对指示剂的整体稳定性和系统的有效性具有负面影响。此外，需要更长的时间来筛选酶活性。

15、因此，仍然需要既可靠又具有成本效益、能够减少温育和/或读出时间且不涉及昂贵的程序和/或要求的生物指示器。

16、另外，期望指示剂不需要包含蛋白质印迹分析、蛋白质阵列分析、磁分离分析、质谱分析、肽分析、色谱分析或气相色谱分析的开发阶段，这些阶段需要专门的设备并且相当耗时。

17、另一方面，生物指示器不依赖于酶反应来间接确定灭菌过程的结果这一事实提供了更可靠的结果。酶促反应是复杂的物理和化学现象，其需要广泛的有利条件才能发生。例如，如本领域技术人员已知的，酶活性很大程度上取决于酶活性位点的结构和性质。即使这些活性位点的任何特征或酶周围的环境条件发生微小变化，也可能对酶正确地进行反应的能力产生重大影响。这种变化的可能性涉及依赖酶反应的生物指示器带来严重的潜在缺陷，因为这些可能会错误地表明灭菌的成功性。

技术实现思路

0、发明简述

1、本发明仅依赖于两个简单且直接的测试的结果，即荧光强度测试和比色测试，使得整个过程相对于现有技术显著更具时间和成本效益。

2、在第一方面，本发明涉及用于确定氧化灭菌过程的功效的自备式生物指示器，其采用立即荧光信号检测和一定温育时间后的比色测试。

3、因此，本技术的目的是提供用于确定包含柔性容器的氧化灭菌过程的功效的设备，其包含：

4、a)一组微生物孢子，

5、b)至少一种荧光传感蛋白，

6、c)培养基，和

7、d)ph指示剂或比色组分，用于扩展读出确认。

8、当至少一种荧光传感蛋白由于氧化灭菌过程而未处于变性状态时，所述至少一种荧光传感蛋白能够产生光学可检测信号，即荧光信号，并且当所述至少一种荧光传感蛋白在氧化灭菌过程后处于变性状态时，还能够产生不同的光学可检测信号，即不同的荧光信号，例如具有不同强度的信号，这取决于该至少一种荧光传感蛋白的三维结构和环境的极性。有利地，这种差异不依赖于至少一种荧光传感蛋白的催化活性和使其与微生物孢子组接触的培养基。

9、所述培养基能够诱导氧化灭菌过程后存在的任何可存活微生物生命的生长，并且包含比色组分，其能够在存在微生物生长的情况下经历光学可检测的颜色变化。

10、在本发明的实施方案中，氧化灭菌过程是采用选自臭氧、氧气、过氧化氢和硫酸的氧化剂的过程。优选地，氧化灭菌过程是过氧化氢灭菌过程。

11、在本发明的实施方案中，a)中的微生物孢子组是细菌孢子。

12、在本发明的优选实施方案中，a)中的微生物孢子组是选自萎缩芽孢杆菌(b.atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(g.stearothermophilus)和短小芽孢杆菌(b.pumilus)的细菌孢子。

13、在本发明的优选实施方案中，微生物孢子包埋在载体中。

14、在本发明的另一优选实施方案中，所述荧光传感蛋白也包埋于所述载体中。

15、在本发明的另一实施方案中，所述荧光传感蛋白选自绿色荧光蛋白(gfpwt、egfp、sfgfp、emerald、avgfp、t-saphire)、蓝色荧光蛋白(sirius、azurite、ebfp、ebfp2、mkalama1、taggfp)、青色荧光蛋白(ecfp、cerulean、cypet、mturquoise2、scfp)、黄色荧光蛋白(yfp、citrine、venus、ypet、syfp、topaz、mametrina)、红色荧光蛋白(tdtomato、mplum、dsred、mcherry、mstrawberry、mraspberry、mruby)和橙色荧光蛋白(morange、mko和morange2)。

16、另外，也可以使用这些荧光蛋白的嵌合蛋白，以及包含与非荧光蛋白融合的荧光蛋白的嵌合蛋白，所述非荧光蛋白例如纤维蛋白、弹性蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、角蛋白、白蛋白和酶，像溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、葡糖苷酶、磷酸酶、半乳糖苷酶、胰凝乳蛋白酶和脂肪酶，但这只是由于它们的结构特征，而不是与它们的催化活性有关。

17、在本发明的优选实施方案中，培养基包含在易碎安瓿瓶中。

18、在本发明的另一实施方案中，培养基组分包含细菌蛋白胨、酵母提取物和l-缬氨酸。

19、在本发明的优选实施方案中，培养基包含比色组分。

20、在本发明的实施方案中，培养基的比色组分选自溴甲酚紫、溴甲酚绿、酚红、百里酚蓝、溴酚蓝、溴百里酚蓝、6-氯-3-吲哚氧基-α-d-吡喃葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基α-d-吡喃葡萄糖苷、6-氯-3-吲哚氧基-β-d-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-d-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸酯。

21、在本发明又一个更优选的实施方案中，荧光传感蛋白和微生物孢子作为制剂在载体中混合在一起。

22、在本发明的一个优选实施方案中，所述易碎安瓿瓶由具有低热膨胀系数，优选硼硅玻璃的材料制成。

23、在本发明的第二方面，另一目的是使用前述本发明的生物指示器的方法，所述使用方法通常包括：

24、a)将生物指示器与待灭菌的目标材料一起放置在灭菌器内，

25、b)进行氧化灭菌过程，

26、c)将生物指示器放置在培养箱中，

27、d)在培养箱中温育生物指示器的同时，筛选生物指示器其荧光强度的立即可检测的变化，

28、e)基于步骤d)期间进行的筛选确定氧化灭菌过程的功效，

29、f)延长步骤d)中获得的生物指示器的温育时间，

30、g)筛选步骤e)中获得的温育的生物指示器的光学可检测的颜色变化，以及

31、h)根据步骤g)中获得的光学可检测变化确定氧化灭菌过程的功效。

32、在本发明方法的一个实施方案中，在步骤a)和b)中，将生物指示器放置在灭菌器内部并位于目标材料旁边。

33、在本发明方法的优选实施方案中，所述培养箱选自terragene incubator reader(ic10/20fr或ic10/20frlcd)或minibio培养箱。

34、在本发明方法的另一实施方案中，在步骤c)中，将预先准备的可用培养箱的温度设定在55-65℃，优选58-62℃的范围内，更优选60℃。

35、在本发明方法的实施方案中，在步骤c)期间，在将生物指示器放置在培养箱内之前立即压碎安瓿瓶。

36、在本发明方法的实施方案中，在步骤d)期间，在灭菌之后和开始温育时立即筛选生物指示器的荧光强度变化。

37、在本发明方法的实施方案中，在步骤g)期间，根据从步骤d)和g)获得的结果来确定氧化灭菌过程的功效。步骤d)或f)中任一步骤的阳性结果表明灭菌过程的不完整或失败。