一种与细胞增殖相关的试剂的制作方法

本技术涉及生物领域，具体的涉及一种与细胞增殖相关的试剂。

背景技术：

1、突触核蛋白是一种由127～140个氨基酸组成的小分子蛋白质，为广泛分布于中枢神经系统突触前成分内的小分子可溶性蛋白质家族，由α-突触核蛋白(snca)、β-突触核蛋白(sncb)和γ-sncg的。γ-突触核蛋白基因(sncg)，又称乳腺癌特异性基因，与已知的α-和β-突触核蛋白同属突触核蛋白基因家族。对突触核蛋白家族的研究一直是神经变性疾病领域的热点，它的表达异常影响多巴胺能神经元功能，导致阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的发生和发展。

2、突触核蛋白家族的表达与阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病相关，为神经变性疾病领域研究的热点之一。sncg是该家族的第三个成员,正常情况下，sncg表达于外周神经元、眼组织和脂肪，与神经退行性疾病无明显关系,但与肿瘤疾病关系密切。sncg最早发现于人乳腺癌cd-na文库，又称乳腺癌易感基因1(breastcancergene1,brca1)。随后有多项研究发现sncg在卵巢癌、肺癌、肝癌、食道癌和结肠癌中的表达都会升高，可促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移，并能干扰药物诱导的细胞凋亡。研究发现sncg通过akt通路促进非小细胞肺癌的发生发展；研究发现sncg的过表达能促进子宫内膜癌的侵袭与转移，并且高表达的患者预后不良；另外研究发现sncg可通过twist1靶点促进tgf-β诱导癌细胞的迁移和侵袭，从而促进肿瘤的进展。

3、sncg蛋白的过表达与pi3k/akt通路的相关性研究，不仅仅只出现在卵巢癌中。在宫颈癌中发现抑制sncg代表的过表达可通过akt信号通路致使肿瘤细胞的活力降低、诱导细胞凋亡并使细胞周期阻滞在g0/g1期，从而抑制肿瘤的发生发展。研究表明发现sncg可充当热休克蛋白(hsps)的分子伴侣的功能，并在hsp90被17-agg破坏时保护akt和mtor信号通路，从而促进肿瘤进展。研究表明过表达的sncg蛋白可刺激雌激素依赖性的肿瘤比如乳腺癌以及卵巢癌等肿瘤的进展，总之sncg为一种多功能的蛋白，在肿瘤的发生发展中起到了重要作用。

4、有研究表明sncg可作为肝癌、食管癌、结肠癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌多种恶性肿瘤的分期特异性蛋白，即分期越高，sncg表达水平越高。ⅲ一ⅳ期乳腺癌中sncg的阳性表达率为71.4％，而在i/ⅱ期乳腺癌中，其阳性表达率仅为26.8％。

5、通过基因转染发现，人类乳癌细胞株sncg-mcf7(scng阳性)的生长速度为neo-mcf7(sncg阴性)的3.2倍。mcf7的生长可被抑瘤素m(om)显著抑制，而当sncg组成性表达于mcf7后，om的生长抑制效应可被逆转。om可能通过改变c-mye、p53、sncg等系列基因的表达而抑制细胞生长，当sncg人工过表达后，它可能克服了om对这些基因表达的干扰，成了促进细胞生长的主要因子。这一试验表明sncg的表达显著刺激了乳癌细胞的增殖。用稳定转染的人类乳癌细胞sncg-435(sncg阳性)及neo-435(sncg阴性)分别进行裸鼠注射种植，二者的肿瘤发生率及肿瘤直径并无明显差异，但区域淋巴结的平均重量分别为44mg和15mg，巴结转移率分别为77％和24％，肺表面肉眼可见转移瘤平均数目分别为23和1。镜检发现，neo-435种植小鼠肺微转移灶数目明显少于sncg-435种植小鼠。进一步体外试验发现，sncg-435-1克隆和sncg-435-3克隆穿透基质胶的细胞数分别为neo克隆的3倍和4.3倍，而二者的迁移能力分别为neo克隆的4倍和4.2倍。这些试验提示，sncg的表达极大地提升了乳癌细胞的浸润和迁移能力，并由此促进了肿瘤的转移。

6、基于sncg的重要性，现有技术已经有针对sncg靶点进行敲除进而用于治疗癌症的研究。比如现有技术通过sirna-sncg下调p-akt和p-erk表达抑制mda-mb231肿瘤细胞迁移和增殖。在乳腺癌mcf细胞株研究发现，sncg通过激活erk通路和破坏细胞间连接来促进肿瘤细胞迁移，抑制sncg的活性后，能够有效的抑制肿瘤细胞的迁移和活性。但是目前，针对sncg的抑制剂种类还不够多，而且主要集中在sirna领域的研究，针对sncg设计特异性的单克隆抗体从而方便给药研究目前还比较少，值得进一步的开发和研究。

技术实现思路

1、本发明提供了一种特异性针对sncg的单克隆抗体。

2、具体的，本技术的sncg的单克隆抗体的轻链可变区序列如seq id no：1所示，重链可变区序列如seq id no：2所示。

3、进一步的，本技术还提供一种经修饰的但是仍保留单抗活性的单克隆抗体变体。

4、具体的，所述变体为在sncg的单克隆抗体的轻链可变区序列seq id no：1所示序列的基础上进行氨基酸的缺失、取代或添加一个或多个氨基酸。

5、“缺失、取代或添加一个或多个氨基酸”是指，利用定点突变法等公知的突变肽制作方法，使能够缺失、取代或添加的程度的数量(优选为10个以下、更优选为7个以下、进一步优选为5个以下)的氨基酸发生缺失、取代或添加。这种突变蛋白质不限于具有通过公知的突变多肽制作方法人为导入的突变的蛋白质，也可以是对天然存在的蛋白质进行分离纯化而得到的蛋白质。蛋白质的氨基酸序列中的若干个氨基酸可以容易地进行改变而不会显著影响该蛋白质的结构或功能，这在本领域中是公知的。此外，还公知的是：不仅对于人为改变是如此，在天然的蛋白质中，也存在不显著改变该蛋白质的结构或功能的突变体。

6、优选的突变体具有保守性或非保守性的氨基酸取代、缺失或添加。优选沉默取代、缺失和添加，特别优选保守性取代。这些突变不会改变本发明的多肽的活性。被看作代表性的保守性取代的是：脂肪族氨基酸ala、val、leu和ile中的一个氨基酸取代为其它氨基酸；羟基残基ser和thr的交换；酸性残基asp和glu的交换；酰胺基残基asn和gln间的取代；碱性残基lys和arg的交换；以及芳香族残基phe、tyr间的取代。

7、进一步的，本发明还提供sncg的单克隆抗体在制备用于抑制细胞中sncg蛋白活性的试剂或者试剂盒中的用途。

8、进一步的，本发明还提供sncg的单克隆抗体在制备用于抑制癌细胞活性的药物组合物中的用途。

9、具体的，所述的药物组合物还含有药学上可接受的载体。

10、所述载体具体为药学领域的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂。

11、其进一步包含一种或几种药物上可接受的赋形剂。根据本发明的赋形剂优选选自稀释剂、崩解剂、载体、粘合剂、流动调节剂、润滑剂及溶剂。技术熟练的人员已知及已发现适用于本发明固体制剂的任何其他赋形剂亦可包含于本发明固体制剂中。该赋形剂更优选选自下列的载体/崩解剂：乳糖、淀粉、纤维素、微晶纤维素及纤维素衍行物，例如，甲基纤维素等。技术熟练的人员已知且已发现适用于本发明固体制剂的任何其他载体可包含于本发明的固体制剂中。

12、药物组合物中进一步含有粘合剂，例如蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠(cmc钠)、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基纤维素(hpc)、聚乙酸乙烯酯或聚乙二醇。粘合剂通常以占所述组合物重量的0.1-10％的量存在。优选地，所述粘合剂以占所述组合物重量的0.2-5％的量存在，例如以占所述组合物重量的0.5-5％的量，更优选以占所述组合物重量的1-3％的量存在。

13、进一步的，本发明的癌细胞为biu-87细胞。

14、有益效果

15、本发明以sncg蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤技术制备并获得了特异性针对sncg的单克隆抗体，该单克隆抗体具有较好的结合sncg蛋白的能力。针对癌细胞施加本技术的单克隆抗体后能够有效的抑制癌细胞的存活率以及在小鼠体内肿瘤的生成，生物活性较好。