一种纯化蛋白的方法与流程

本公开涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种纯化蛋白(例如低等电点蛋白，例如低等电点抗体)的方法，特别是添加特定浓度及种类保护剂，有效避免缓冲体系跨越分子不稳定ph区间时样品不稳定的现象，并使用整合于蛋白纯化仪器的在线检测器实时监测流路中样品浑浊程度变化，及创新性的使用“阳离子交换层析流穿模式+阴离子交换层析结合洗脱模式”对工艺相关杂质进行有效去除。

背景技术：

1、随着生物医药的不断发展，抗体药物显示出越来越重要的地位。对含有目标抗体培养物进行分离纯化是其生产过程中必不可少的步骤，如何通过优化抗体的纯化条件，进一步增加去除杂质的效率，提高抗体的纯度和收率是目前工业化生产中重要的问题。

2、天然抗体分子等电点多数为ph 7.5～9.5，通常使用亲和层析、离子交换层析及疏水层析等技术手段，将抗体分子从培养液中分离及精纯。亲和层析填料配基可在近中性条件下特异性与抗体结合，在较低ph条件下与抗体分离。宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、亲和层析脱落的proa配基等工艺相关杂质通常等电点较低，与抗体分子具有较大的电荷差异。通常使用阴离子交换层析流穿模式去除工艺相关杂质，即在特定条件下，抗体分子表面电荷以正电荷为主而直接流过层析柱，而工艺相关杂质表面电荷以负电荷为主进而吸附在层析柱上。通常使用阳离子交换层析对抗体分子进行精纯，即在特定条件下，工艺相关杂质表面电荷以负电荷为主直接流过层析柱，抗体分子表面电荷以正电荷为主吸附在层析柱上，然后通过提高缓冲体系离子强度或改变缓冲体系ph洗脱抗体分子。

3、等电点较低蛋白(例如抗体)的纯化面临极大的挑战，包括但不限于1)亲和层析过程中缓冲体系ph接近蛋白(例如抗体)分子等电点时，分子稳定性显著变差，由于分子间作用力增强或分子空间构象转变，洗脱所得中间产物呈乳光或浑浊状，聚集体含量显著增加；2)工艺相关杂质与蛋白(例如抗体)分子等电点接近，常规中纯或精纯手段无法有效去除；3)抗体纯化领域通常使用的“阴离子交换层析流穿模式+阳离子交换层析结合洗脱模式“无法使用”。

技术实现思路

1、本公开涉及一种纯化低等电点蛋白(例如抗体)的方法，有效抑制了纯化过程中蛋白(例如抗体)分子的不稳定状态，并对工艺相关杂质进行了有效地去除。

2、本公开提供一种纯化蛋白(例如抗体)的方法，该方法包括以下步骤：

3、a)亲和层析；

4、b)流穿模式的阳离子交换层析；和

5、c)结合洗脱模式的阴离子交换层析。

6、所述蛋白是能被亲和层析柱层析的蛋白，例如抗体或含有抗体fc的融合蛋白。

7、在一些实施方案中，所述蛋白(例如抗体)的等电点为约3.0至约10.0，例如等电点为约3.0至约8.0、约5.0至约7.5、约5.0至约7.0、约5.0至约6.8、约5.0至约6.0，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，所述蛋白(例如抗体)是一种低等电点抗体。在一些实施方案中，所述蛋白(例如抗体)的等电点低于6.5，例如等电点为约2.0至约6.5、约3.0至约6.4、约4.0至约6.3、约5.0至约6.5、约5.5至约6.0、约5.7至约6.0、约5.7至约5.9、约5.7至约5.8、约5.7至约6.5、约6.0至约6.5，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，所述蛋白(例如抗体)的等电点为约5.7至约6.0。

8、在一些实施方案中，进一步地，所述蛋白(例如抗体)的重链及轻链等电点差异较大。在一些实施方案中，进一步地，所述蛋白(例如抗体)的重链及轻链等电点差异大于约1.0至约4.5单位，例如约1.0至约4.5单位、约1.0至约4.0单位、约1.0至约3.5单位、约1.0至约2.0单位、约1.0至约1.5单位。一些实施方案中，进一步地，所述蛋白(例如抗体)的重链及轻链等电点差异大于包括但不限于约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5单位。

9、在一些实施方案中，所述步骤a)亲和层析包括以下步骤：

10、a-1)上样：将包含蛋白(例如抗体)的细胞培养澄清液加载到预处理好的亲和层析填料上；

11、a-2)平衡：用平衡缓冲液清洗亲和层析填料；

12、a-3)预洗：用预洗缓冲液清洗亲和层析填料；

13、a-4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；

14、在一些实施方案中，所述步骤b)流穿模式的阳离子交换层析包括以下步骤：

15、b-1)样品调节：将亲和层析洗脱产物ph调节至高于蛋白(例如抗体)等电点；

16、b-2)上样：将调节后的洗脱产物加载到预处理好的阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；

17、b-3)平衡：用平衡缓冲液清洗阳离子交换层析填料，收集冲洗样品；

18、可选地，还进一步包含步骤b-4)样品合并：将步骤b-2)及步骤b-3)所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；

19、在一些实施方案中，所述步骤c)结合洗脱模式的阴离子交换层析包括以下步骤：

20、c-1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的阴离子交换层析填料上；

21、c-2)平衡：用平衡缓冲液清洗阴离子交换层析填料；

22、c-3)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。

23、本公开提供一种纯化蛋白(例如抗体)的方法，包括以下步骤：

24、a)亲和层析

25、a-1)上样：将包含蛋白(例如抗体)的细胞培养澄清液加载到预处理好的亲和层析填料上；

26、a-2)平衡：用平衡缓冲液清洗亲和层析填料；

27、a-3)预洗：用预洗缓冲液清洗亲和层析填料；

28、a-4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；

29、b)流穿模式的阳离子交换层析

30、b-1)样品调节：将亲和层析洗脱产物ph调节至高于蛋白(例如抗体)

31、等电点；

32、b-2)上样：将调节后的洗脱产物加载到预处理好的阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；

33、b-3)平衡：用平衡缓冲液清洗阳离子交换层析填料，收集冲洗样品；

34、可选地，还进一步包含步骤b-4)样品合并：将步骤b-2)及步骤b-3)

35、所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；

36、c)结合洗脱模式的阴离子交换层析

37、c-1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的阴离子交换层析填料上；

38、c-2)平衡：用平衡缓冲液清洗阴离子交换层析填料；

39、c-3)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。

40、在一些实施方案中，前述任一项步骤a-3)预洗缓冲液或a-4)洗脱缓冲液中还进一步包括保护剂，所述保护剂选自氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、精氨酸、精氨酸盐酸盐、组氨酸、组氨酸盐酸盐、赖氨酸、赖氨酸盐酸盐、天冬氨酸中的一种或多种。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-3)预洗缓冲液或a-4)洗脱缓冲液中还进一步包括精氨酸盐酸盐。

41、在一些实施方案中，所述保护剂的浓度为约1至约500mm，例如约1mm至约400mm、约5mm至约300mm、约10mm至约200mm、约20mm至约100mm、约20mm至约50mm、约10mm至约70mm、约1mm至约100mm，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，所述保护剂的浓度为包括但不限于约10mm、约20mm、约50mm、约70mm、约100mm。

42、在一些具体实施方案中，前述任一项步骤a-3)预洗缓冲液中还进一步包括精氨酸盐酸盐，所述精氨酸盐酸盐的浓度为约50mm。

43、在一些具体实施方案中，前述任一项步骤a-4)洗脱缓冲液中还进一步包括精氨酸盐酸盐，所述精氨酸盐酸盐的浓度为约20mm、约50mm或约100mm。

44、在一些实施方案中，前述任一项步骤a)所用的亲和层析填料选自protein a配基交联到包括但不限于琼脂糖、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、玻璃等基质上的层析介质。在一些实施方案中，所述基质为琼脂糖。在一些实施方案中，前述任一项步骤a)所用的亲和层析填料是mabselect prisma。

45、在一些实施方案中，前述任一项步骤a)、b)或c)的平衡缓冲液、预洗缓冲液或洗脱缓冲液中的缓冲物质选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、tris-盐酸、tris-醋酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、醋酸-醋酸钠中的一种或多种。

46、在一些实施方案中，前述任一项步骤a)、b)或c)的平衡缓冲液、预洗缓冲液或洗脱缓冲液的浓度为约10至约100mm，例如约10至约80mm、约10至约60mm、约10至约50mm、约20至约50mm、约20至约70mm、约20至约90mm、约30至约55mm、约30至约75mm、约40至约100mm、约40至约60mm，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-2)平衡缓冲液的浓度例如为约40mm、约50mm、约60mm、约80mm、约90mm。

47、在一些实施方案中，前述任一项步骤a-2)平衡缓冲液的ph为约7.0至约8.0，例如约7.0至约7.8、约7.2至约7.6、约7.2至约7.4、约7.4至约8.0，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-2)平衡缓冲液ph为包括但不限于约7.4。

48、在一些实施方案中，前述任一项步骤a-3)预洗缓冲液的ph为低于抗体等电点。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-3)预洗缓冲液的ph为低于抗体等电点约0.1至约2.5单位，例如约0.1至约2.0、约0.3至约1.5、约0.5至约1.0、约0.6至约2.5、约0.8至约2.0、约1.0至约1.5，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-3)预洗缓冲液的ph为低于蛋白(例如抗体)等电点包括但不限于约0.3、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5。示例性地，预洗缓冲液的ph可以为约5.1，但不限于此。

49、在一些实施方案中，前述任一项步骤a-4)洗脱缓冲液的ph为约3.0至约5.0，例如约3.0至约4.5、约3.2至约4.2、约3.4至约4.0、约3.6至约3.8，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-4)洗脱缓冲液ph为包括但不限于约3.7。

50、在一些实施方案中，前述任一项步骤b)所用的阳离子交换层析填料包括但不限于capto s，capto s impact，capto sp impres，capto sp hp，poros xs，poros hs，eshmunocpx。在一些实施方案中，前述任一项步骤b)所用的阳离子交换层析填料为eshmuno cpx。

51、在一些实施方案中，前述任一项步骤b-1)使用tris将亲和层析洗脱产物ph调节至高于抗体等电点。

52、在一些实施方案中，上述步骤b-1)使用的tris浓度为约0.01m至约100m，例如约0.1m至约10m、约0.5m至约5m、约0.7m至约3m、约1.0m至约2.0m、约1.0m至约10.0m，或者为这些点值之间的任意范围。在一些具体实施方案中，上述步骤b-1)使用的tris浓度为约1.0m。

53、在一些实施方案中，前述任一项步骤b-1)使用tris将亲和层析洗脱产物ph调节至高于抗体等电点约0.1至约3.0单位，例如约0.1至约2.5单位、约0.3至约2.0单位、约0.5至约1.5单位、约0.5至约1.0单位、约0.1至约1.0单位、约0.1至约0.5单位、约0.4至约0.6单位，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项步骤b-1)使用tris将亲和层析洗脱产物ph调节至高于抗体等电点包括但不限于约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9单位。示例性地，ph调节至约6.4至约6.6，但不限于此。

54、在一些实施方案中，前述任一项步骤b-1)样品调节中还进一步包括使用去离子水将样品稀释至电导率<5ms/cm，例如电导率<4ms/cm、<3ms/cm、<2ms/cm、<1ms/cm，或者为这些范围内任意点值。在一些实施方案中，所述去离子水选自纯水、高纯水、超纯水。

55、在一些实施方案中，前述任一项步骤b-3)平衡缓冲液中的缓冲物质ph与上样样品一致。

56、在一些实施方案中，前述任一项步骤c)所用的阴离子交换介质包括但不限于capto q，capto q impres,capto q xp，poros hq，fractogel emd tmae，capto adhere,capto adhere impres。在一些具体实施方案中，前述任一项步骤c)所用的阴离子交换介质为fractogel emd tmae。

57、在一些实施方案中，前述任一项步骤c-2)平衡缓冲液或c-3)洗脱缓冲液的ph高于抗体等电点约0.1至约5.0单位，例如约0.1至约4.0单位、约0.3至约3.0单位、约0.5至约2.0单位、约0.5至约1.0单位、约0.3至约1.0单位、约0.1至约1.5单位、约1.0至约2.0单位、约2.0至约4.0单位、约3.0至约5.0单位，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项c-2)平衡缓冲液或c-3)洗脱缓冲液的ph高于抗体等电点包括但不限于约0.3单位、约0.5单位、约0.8单位、约1.0单位、约1.5单位、约2.0单位。示例性地，步骤c-2)平衡缓冲液的ph为约6.5，但不限于此。

58、在一些实施方案中，前述任一项步骤c-3)洗脱缓冲液中还进一步包括氯化钠、精氨酸、精氨酸盐酸盐、组氨酸、组氨酸盐酸盐、甘氨酸中的一种或多种。在一些具体实施方案中，前述任一项步骤c-3)洗脱缓冲液中还进一步包括氯化钠。在一些实施方案中，所述氯化钠的浓度为约1mm至约1000mm，例如约1mm至约800mm、约10mm至约500mm、约50mm至约300mm、约100mm至约200mm、约150mm至约180mm，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，所述氯化钠的浓度为包括但不限于约50mm、约100mm、约135mm、约150mm、约200mm、约300mm、约400mm。

59、在一些实施方案中，前述任一项步骤c-3)洗脱缓冲液的电导率为约1至约50ms/cm，例如约8ms/cm至约50ms/cm、约10ms/cm至约40ms/cm、约15ms/cm至约30ms/cm、约18ms/cm至约20ms/cm、约18ms/cm至约50ms/cm。在一些实施方案中，前述任一项步骤c-3)洗脱缓冲液的电导率为包括但不限于约15ms/cm、约18ms/cm、约20ms/cm、约30ms/cm、约40ms/cm、约50ms/cm。在一些具体实施方案中，前述任一项步骤c-3)洗脱缓冲液的电导率为约18ms/cm。

60、在一些实施方案中，前述任一项步骤a)、b)或c)的平衡缓冲液或预洗缓冲液冲洗1至10个柱体积，例如约2至8个柱体积、3至5个柱体积、4至7个柱体积，或者为这些点值之间的任意范围。在一些具体实施方案中，前述任一项步骤a)、b)或c)的平衡缓冲液或预洗缓冲液冲洗3至5个柱体积。

61、在一些实施方案中，前述任一项步骤a)、b)或c)在上样前还包括使用消毒液、预平衡缓冲液、平衡缓冲液预处理层析柱。在一些实施方案中，所述消毒液为0.5m氢氧化钠。

62、在一些实施方案中，前述的预处理层析柱使用的预平衡缓冲液、平衡缓冲液中的缓冲物质选自磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、tris-盐酸、tris-醋酸、磷酸氢二钠-柠檬酸、醋酸-醋酸钠中的一种或多种。

63、在一些实施方案中，前述的预处理层析柱使用的预平衡缓冲液、平衡缓冲液的浓度为约10至约100mm，例如约10至约80mm、约10至约60mm、约10至约50mm、约20至约50mm、约20至约70mm、约20至约90mm、约30至约55mm、约30至约75mm、约40至约100mm、约40至约60mm，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-2)平衡缓冲液的浓度为包括但不限于约40mm、约50mm、约60mm、约80mm、约90mm。

64、在一些实施方案中，前述的预处理层析柱使用的预平衡缓冲液、平衡缓冲液的ph为约6.0至约8.0，例如约6.0至约7.5、约6.5至约8.0、约6.5至约7.4、约7.4至约8.0、约7.0至约8.0，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，前述任一项步骤a-2)平衡缓冲液ph为包括但不限于约6.5、约7.0、约7.4。

65、在一些实施方案中，前述的预处理层析柱使用的预平衡缓冲液中还进一步包括氯化钠、精氨酸、精氨酸盐酸盐、组氨酸、组氨酸盐酸盐、甘氨酸中的一种或多种。在一些具体实施方案中，前述的预处理层析柱使用的预平衡缓冲中还进一步包括氯化钠。在一些实施方案中，所述氯化钠的浓度为约0.01至约10m，例如约0.1m至约10m、约0.5m至约5m、约0.5m至约3.0m、约0.8m至约2.0m、约1.0m至约2.0m，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，所述氯化钠的浓度为包括但不限于约0.5m、约1m、约1.5m、约2m。

66、在一些实施方案中，前述任一项步骤a)在上样前预处理层析柱时使用的预平衡缓冲液为包含约20mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，约1m氯化钠，ph为约7.4的缓冲液。

67、在一些实施方案中，前述任一项步骤a)在上样前预处理层析柱时使用的平衡缓冲液为包含约50mm tris-盐酸，ph为约7.4的缓冲液。

68、在一些实施方案中，前述任一项步骤b)在上样前预处理层析柱时使用的预平衡缓冲液为包含约50mm tris-盐酸，1m氯化钠，ph为约7.0的缓冲液。

69、在一些实施方案中，前述任一项步骤b)在上样前预处理层析柱时使用的平衡缓冲液为包含约50mm tris-盐酸，ph为约6.5的缓冲液。

70、在一些实施方案中，前述任一项步骤c)在上样前预处理层析柱时使用的预平衡缓冲液为包含约50mm tris-盐酸，1m氯化钠，ph为约6.5的缓冲液。

71、在一些实施方案中，前述任一项步骤c)在上样前预处理层析柱时使用的平衡缓冲液为包含约50mm tris-盐酸，ph为约6.5的缓冲液。

72、在一些实施方案中，本公开的抗体的等电点为约3.0至约10.0，例如等电点为约3.0至约8.0、约5.0至约7.5、约5.0至约7.0、约5.0至约6.8、约5.0至约6.0，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，所述抗体是一种低等电点抗体。在一些实施方案中，本公开抗体的等电点低于6.5，例如等电点为约2.0至约6.5、约3.0至约6.4、约4.0至约6.3、约5.0至约6.5、约5.5至约6.0、约5.7至约6.0、约5.7至约5.9、约5.7至约5.8、约5.7至约6.5、约6.0至约6.5，或者为这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，本公开述抗体的等电点为约5.7至约6.0。

73、在一些实施方案中，进一步地，本公开的蛋白(例如抗体或包含抗体的蛋白)的重链及轻链等电点差异较大。在一些实施方案中，进一步地，本公开蛋白(例如抗体或包含抗体的蛋白)的重链及轻链等电点差异大于约1.0至约4.5单位，例如约1.0至约4.5单位、约1.0至约4.0单位、约1.0至约3.5单位、约1.0至约2.0单位、约1.0至约1.5单位。一些实施方案中，进一步地，本公开蛋白(例如抗体或包含抗体的蛋白)的重链及轻链等电点差异大于包括但不限于约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5单位。

74、在一些实施方案中，本公开的抗体选自单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、cdr移植抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、二硫键连接的fv、scfv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体和双特异性抗体。

75、在一些实施方案中，本公开的抗体结合选自组织因子、il-6、il-6受体、hm1.24抗原、甲状旁腺激素相关肽(pthrp)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、神经节苷脂gm3、tpo受体、第viii凝固因子、il31受体、hla、axl、cxcr4、nr10、因子ix、因子x、因子xi或因子xia(fxi/fxia)中的任意一种或多种，但不限于这些。

76、在一些实施方案中，本公开的抗体是一种抗fxi/fxia抗体。

77、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包含分别如seq id no：7、8、9所示的hcdr1、hcdr2、hcdr3，和所述轻链可变区包含分别如seq id no：10、11、12所示的lcdr1、lcdr2、lcdr3。

78、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体可选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，例如人源化抗体。

79、在可选实施方案中，其中所述的人源化抗fxi/fxia抗体轻链和重链可变区上的轻链和重链fr序列分别来源于人种系轻链和重链的fr或其突变序列。

80、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：

81、重链可变区序列如seq id no：5或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：6或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

82、重链可变区序列如seq id no：13或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：14或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

83、重链可变区序列如seq id no：15或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：16或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

84、重链可变区序列如seq id no：17或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，轻链可变区序列如seq id no：16或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列；

85、在一些具体实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体包含抗体重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区序列如seq id no：17所示，和所述轻链可变区序列如seq idno：16所示。

86、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。在可选的实施方案中，所述重链恒定区选自人igg1、igg2、igg3、igg4、igg4p(即igg4的s241p突变体)恒定区，所述轻链恒定区选自人κ和λ链恒定区。所述igg4p fc(即包含s241p的igg4 fc)的序列例如seq id no：19所示。在一些实施方案中，所述重链恒定区的序列如seq id no：20所示或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，和/或所述轻链恒定区的序列如seq id no：22所示或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列。

87、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体包含重链和轻链，其中：所述重链具有seq id no：21所示的序列或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列，和所述轻链具有seq id no：22所示的序列或与之具有至少80％、至少85％、至少90％同一性的序列。

88、本公开中，所述“至少90％同一性”涵盖至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性。

89、在一些具体实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体包含抗体重链和轻链，其中：所述重链序列如seq id no：21所示，和所述轻链序列如seq id no：22所示。

90、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体的抗原结合片段为fab、fv、sfv、fab’、f(ab’)2、线性抗体、单链抗体、scfv、sdab、sdfv、纳米抗体、肽抗体peptibody、结构域抗体和多特异性抗体(双特异性抗体、diabody、triabody和tetrabody、串联二-scfv、串联三-scfv)，例如具体为scfv、fv、fab或fab’片段。

91、在一些实施方案中，其中所述抗fxi/fxia抗体的重链可变区和/或轻链可变区包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。所述氨基酸变化可以是可变区中的氨基酸残基保守性置换。

92、在一些实施方案中，上述抗fxi/fxia抗体可以具有以下任一或任几项的特性：

93、防止内在凝血途径或共同凝血途径的活化；

94、阻断fxi和/或fxia结合至凝血因子ix、凝血因子xiia或凝血酶中的一个或多个及凝血途径的其他组分；

95、阻断fix、fxi及fxia中的一个或多个结合至血小板受体；

96、具有以≤10-9kd结合至人fxi和/或fxia蛋白；

97、结合至fxi/fxia时阻止fxi/fxia催化结构域呈现活性构象；

98、可用于皮下给药或静脉给药。

99、上述亲和力的测定方式例如是biacoretm。

100、本公开包括以下实施方案：

101、1、一种纯化蛋白(例如抗体)的方法，包括以下步骤：

102、a)亲和层析

103、a-1)上样：将包含蛋白(例如抗体)的细胞培养澄清液加载到预处理好的亲和层析填料上；

104、a-2)平衡：用平衡缓冲液清洗亲和层析填料；

105、a-3)预洗：用预洗缓冲液清洗亲和层析填料；

106、a-4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；

107、b)流穿模式的阳离子交换层析

108、b-1)样品调节：将亲和层析洗脱产物ph调节至高于抗体等电点；

109、b-2)上样：将调节后的洗脱产物加载到预处理好的阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；

110、b-3)平衡：用平衡缓冲液清洗阳离子交换层析填料，收集冲洗样品；

111、可选地，还进一步包含步骤b-4)样品合并：将步骤b-2)及步骤b-3)所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；

112、c)结合洗脱模式的阴离子交换层析

113、c-1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的阴离子交换层析填料上；

114、c-2)平衡：用平衡缓冲液清洗阴离子交换层析填料；

115、c-3)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。

116、其中，所述蛋白(例如抗体)的等电点为约3.0至约10.0，例如约2.0至约6.5，更例如约5.7至约6.0，且所述抗体的重链及轻链等电点差异大于约1.0至约4.5单位，例如约1.0至约1.5单位。

117、2、如第1项所述的方法，其中所述步骤a)预洗缓冲液或洗脱缓冲液中还包括约1mm至约100mm的精氨酸盐酸盐。

118、3、如前述任一项所述的方法，其中所述步骤a)所用的亲和层析填料为mabselectprisma，和\或步骤b)所用的阳离子交换层析填料为eshmuno cpx，和\或步骤c)所用的阴离子交换层析填料为fractogel emd tmae。

119、4、如前述任一项所述的方法，其中：

120、步骤a-2)平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约7.4；

121、步骤a-3)预洗缓冲液含有约50mm醋酸钠-醋酸，约50mm精氨酸盐酸盐，ph为约5.1；

122、步骤a-4)洗脱缓冲液含有约50mm醋酸钠-醋酸，约20mm精氨酸盐酸盐，ph为约3.7。

123、步骤b-3)、c-2)平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约6.5；和

124、步骤c-3)洗脱缓冲液含有约50mm tris-盐酸，氯化钠调节，电导率为约18ms/cm。

125、5、如前述任一项所述的方法，其中：

126、步骤b-1)样品调节中使用约1m tris将亲和层析洗脱产物ph调节至高于蛋白(例如抗体)等电点，其中所述ph调节至约6.4至约6.6；和

127、步骤b-1)样品调节中还进一步包括使用去离子水将样品稀释至电导率<5ms/cm，所述去离子水选自纯水、高纯水、超纯水。

128、6、如前述任一项所述的方法，其中所述抗体包含如seq id no:21所示的重链氨基酸序列，和如seq id no:22所示的轻链氨基酸序列。

129、7、一种纯化蛋白(例如抗体)的方法，包括以下步骤：

130、a)亲和层析

131、a-1)上样：将包含蛋白(例如抗体)的细胞培养澄清液加载到预处理好的mabselect prisma亲和层析填料上；

132、a-2)平衡：用平衡缓冲液冲洗3至5个柱体积，其中平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约7.4；

133、a-3)预洗：用预洗缓冲液冲洗3至5个柱体积，其中预洗缓冲液含有约50mm醋酸钠-醋酸，约50mm精氨酸盐酸盐，ph为约5.1；

134、a-4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，其中洗脱缓冲液含有约50mm醋酸钠-醋酸，约20mm精氨酸盐酸盐，ph为约3.7；

135、b)流穿模式的阳离子交换层析

136、b-1)样品调节：使用约1m tris将亲和层析洗脱产物ph调节至高于蛋白(例如抗体)等电点，其中所述ph调节至约6.4至约6.6，并使用去离子水将样品稀释至电导率<5ms/cm，所述去离子水选自纯水、高纯水、超纯水；

137、b-2)上样：将调节后的洗脱产物加载到预处理好的eshmuno cpx阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；

138、3)平衡：用平衡缓冲液冲洗3至5个柱体积，收集冲洗样品，其中平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约6.5；

139、可选地，还进一步包含步骤4)样品合并：将步骤2)及步骤3)所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；

140、c)结合洗脱模式的阴离子交换层析

141、c-1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的fractogel emdtmae阴离子交换层析填料上；

142、c-2)平衡：用平衡缓冲液冲洗3至5个柱体积，其中平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约6.5；

143、c-3)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，其中洗脱缓冲液含有约50mm tris-盐酸，氯化钠调节，电导率为约18ms/cm。

144、8、一种纯化蛋白(例如抗体)的方法，包括以下步骤：

145、a)亲和层析

146、a-1)上样：将包含抗体的细胞培养澄清液加载到预处理好的mabselect prisma亲和层析填料上；

147、a-2)平衡：用平衡缓冲液冲洗3至5个柱体积，其中平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约7.4；

148、a-3)预洗：用预洗缓冲液冲洗3至5个柱体积，其中预洗缓冲液含有约50mm醋酸钠-醋酸，约50mm精氨酸盐酸盐，ph为约5.1；

149、a-4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，其中洗脱缓冲液含有约50mm醋酸钠-醋酸，约20mm精氨酸盐酸盐，ph为约3.7；

150、b)流穿模式的阳离子交换层析

151、b-1)样品调节：使用约1m tris将亲和层析洗脱产物ph调节至高于蛋白(例如抗体)等电点，其中所述ph调节至约6.4至约6.6，并使用去离子水将样品稀释至电导率<5ms/cm，所述去离子水选自纯水、高纯水、超纯水；

152、b-2)上样：将调节后的洗脱产物加载到预处理好的eshmuno cpx阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；

153、b-3)平衡：用平衡缓冲液冲洗3至5个柱体积，收集冲洗样品，其中平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约6.5；

154、可选地，还进一步包含步骤4)样品合并：将步骤2)及步骤3)所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；

155、c)结合洗脱模式的阴离子交换层析

156、c-1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的fractogel emdtmae阴离子交换层析填料上；

157、c-2)平衡：用平衡缓冲液冲洗3至5个柱体积，其中平衡缓冲液含有约50mm tris-盐酸，ph为约6.5；

158、c-3)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，其中洗脱缓冲液含有约50mm tris-盐酸，氯化钠调节，电导率为约18ms/cm。

159、其中，所述蛋白(例如抗体)的等电点为约3.0至约10.0，例如约2.0至约6.5，更例如约5.7至约6.0，且所述抗体的重链及轻链等电点差异大于约1.0至约4.5单位，例如约1.0至约1.5单位。

160、9、一种纯化蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

161、a)亲和层析；

162、b)流穿模式的阳离子交换层析；和

163、c)结合洗脱模式的阴离子交换层析；

164、所述蛋白是能被亲和层析的蛋白，例如抗体或含有抗体fc的融合蛋白；

165、其中，所述步骤a)亲和层析中的预洗缓冲液或洗脱缓冲液中还包括保护剂，所述保护剂选自氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、精氨酸、精氨酸盐酸盐、组氨酸、组氨酸盐酸盐、赖氨酸、赖氨酸盐酸盐、天冬氨酸中的一种或多种，例如所述保护剂为精氨酸盐酸盐，例如所述保护剂为约1mm至约500mm精氨酸盐酸盐，更例如所述保护剂为约1mm至约100mm精氨酸盐酸盐。

166、10、一种纯化蛋白(例如抗体)的方法，包括以下步骤：

167、a)亲和层析

168、a-1)上样：将包含蛋白(例如抗体)的细胞培养澄清液加载到预处理好的亲和层析填料上；

169、a-2)平衡：用平衡缓冲液清洗亲和层析填料；

170、a-3)预洗：用预洗缓冲液清洗亲和层析填料；

171、a-4)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；

172、b)流穿模式的阳离子交换层析

173、b-1)样品调节：将亲和层析洗脱产物ph调节至高于抗体等电点；

174、b-2)上样：将调节后的洗脱产物加载到预处理好的阳离子交换层析填料上，收集流穿样品；

175、b-3)平衡：用平衡缓冲液清洗阳离子交换层析填料，收集冲洗样品；

176、可选地，还进一步包含步骤b-4)样品合并：将步骤b-2)及步骤b-3)所得样品合并，记为阳离子层析合并样品；

177、c)结合洗脱模式的阴离子交换层析

178、c-1)上样：将阳离子层析流穿样品或合并样品加载到预处理好的阴离子交换层析填料上；

179、c-2)平衡：用平衡缓冲液清洗阴离子交换层析填料；

180、c-3)洗脱：用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。

181、其中，所述步骤a)预洗缓冲液或洗脱缓冲液中还包括保护剂，所述保护剂选自氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、精氨酸、精氨酸盐酸盐、组氨酸、组氨酸盐酸盐、赖氨酸、赖氨酸盐酸盐、天冬氨酸中的一种或多种，例如所述保护剂为精氨酸盐酸盐，例如所述保护剂为约1mm至约500mm精氨酸盐酸盐，更例如所述保护剂为约1mm至约100mm精氨酸盐酸盐。