一种体外快速合成环状DNA的方法

本发明涉及基因工程，具体涉及一种体外快速合成环状dna的方法。

背景技术：

1、染色体外环状dna(extrachromosomal circμlar dna,eccdna)是真核生物中一类特殊的环状dna，最早的报道见于1965年，是部分基因组dna在一定条件下从染色体上脱落，通过一系列复杂机制成环，形成的环状dna，其大小从100bp到数百万bp不等,可来源于基因组的不同位点。eccdna能通过多种途径在生理及病理过程中发挥重要的作用，一些研究认为许多重要的原癌基因主要以eccdna为载体进行扩增,表明它与肿瘤细胞癌基因拷贝数增加和基因转录水平提高相关，同时与肿瘤的异质性，转移，耐药以及不良预后相关。然而，单个eccdnas的功能在很大程度上是未知的。主要问题之一是缺乏有效和稳定的方法来在体外合成单个eccdna用于下游测定以探索其功能。

2、目前，体外合成eccdna可以通过使用taq dna连接酶(参考文献：du,q.,kotlyar,a.and vologodskii,a.(2008)kinking the double helix by bendingdeformation.nucleicacidsres,36,1120-1128.)和t4 dna连接酶(参考文献：kuhn,h.andfrank kamenetskii,m.d.(2005)template-independent ligation of single-strandeddnaby t4 dnaligase.thefebsjournal,272,5991-6000.)等方法合成。长度为84～106bp的小环可通过taq dna连接酶合成。这种方法受dna长度的限制，而合成长链dna(>100bp)的价格昂贵。后来，引入了一种非模板连接方法，通过t4 dna连接酶将hindⅲ粘性末端的dna自连接成环，这种连接反应需要0.1-10nm范围内的非常低的dna浓度来抑制分子间连接，因此产量非常低。henrik devitt et al.最近研究表明(参考文献：h.d.,lin,l.,xiang,x.,petersen,t.s.,huang,j.,yang,l.,kjeldsen,e.,jensen,u.b.,zhang,x.and liu,x.et al..(2018)crispr-c:circμlarization of genes and chromosome bycrispr in human cells.nucleicacidsres.)，crispr-c可以从基因间和基因位点生成eccdna，大小范围从几百个碱基对到207kb不等，但这种方法需要一个特定的基因编辑系统，耗时且复杂。是否能深入研究特定序列eccdna的功能，迫切需要开发一种快速、稳定的方法来合成长度范围广的eccdnas。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种体外快速合成环状dna的方法，通过pcr方法提供一种体外简单快速合成eccdna的方法。该方法成功的解决了以往合成eccdna的长度限制以及浓度限制的两大关键问题，为eccdna的分子机制研究提供了可能方案。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种体外快速合成环状dna的方法，包括以下步骤：

4、s1.以基因组为模板，针对所需合成环状dna对应的线性dna片段分别设计正向引物和反向引物进行pcr，产生线性dna-a片段；

5、s2.以步骤s1制得的dna-a片段为模板，分别设计引物产生1/2a片段，分别为dna-c片段和dna-d片段；

6、s3.将步骤s2制得的1/2a片段进行梯度退火，产生黏性dna-c片段和dna-d片段；

7、s4.用t7连接酶连接步骤s3制得的黏性dna-c片段和dna-d片段；

8、s5.以步骤s4制得的dna片段为模板，再进行pcr，产生dna-e片段；

9、s6.将dna-a片段和dna-e片段经过taq dnaligase试剂进行成环反应，制得环状dna。

10、作为本发明的进一步改进，设计1/2a片段的引物设计为互补结构。

11、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述pcr体系如下：2*pcr缓冲液for kodfx20-30μl，2mmdntps 8-12μl，f-primer 1-2μl，r-primer 1-2μl，genomic dna 180-220ng，kodfx 0.5-1.5μl，ddh2o加至50μl。

12、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述pcr反应条件为：90-96℃，2min；95-100℃，10s，50-60℃，30s，65-75℃，3min，30循环；3-5℃，∞。

13、作为本发明的进一步改进，步骤s2和步骤s4的反应体系和反应条件与步骤s1相同。

14、作为本发明的进一步改进，步骤s3的反应体系如下：dna-c片段20μl，dna-c’片段20μl，5*dnaannealing缓冲液10μl，总计50μl。

15、作为本发明的进一步改进，步骤s3的反应条件如下：90-100℃，3min；85-95℃，3min；80-90℃，3min，以每下降5℃维持3min，梯度降温至25℃。

16、作为本发明的进一步改进，步骤s4的反应体系如下：dnaligase reaction缓冲液10μl，黏性dna-c片段5μl，黏性dna-d片段5μl，dnaliagse1μl，总计21μl；反应条件：25℃，30min-1h，失活：65℃，20min。

17、作为本发明的进一步改进，步骤s6的反应体系如下：dna-a片段400-600ng，dna-e片段400-600ng，taq dnaligase reaction缓冲液6-8μl，taq dnaligase1-3μl，ddh2o补足至50μl。

18、作为本发明的进一步改进，步骤s6的反应条件如下：90-100℃，3min，55-65℃，10min，35-40℃，5min，10循环。

19、本发明具有如下有益效果：本发明采用pcr方法体外快速合成环状dna，如图1所示。第一步：以基因组为模板，针对所需合成环状dna对应的线性dna片段分别设计正向引物和反向引物进行pcr，产生浓度较高的线性dna-a片段，确保构建eccdna的dna片段是研究所需，无碱基更换或删减。第二步：以第一步骤dna-a片段为模板，分别设计引物产生1/2a片段(c,d)，应注意设计1/2a片段的引物设计需要互补。第三步：1/2a片段进行梯度退火，产生黏性1/2a片段，设计引物时应注意产生两个1/2a片段的引物需要互补，退火后才可以产生黏性1/2a片段。第四步：t7连接酶连接黏性1/2a片段。第五步：以第四步产物为模板，再进行pcr，产生dna-e片段，e片段。经过前面五个步骤后形成的dna-e片段与dna-a片段的区别是碱基顺序发生了改变。第六步：dna-a和dna-e片段经过taq dnaligase试剂进行成环反应。经酶切消化验证后如图2(以ecclimd1为例)所示，lane1:limd1-a序列dna,lane2:limd1-e序列dna，lane3:limd1-pa，lane4:limd1-pe，lane5:ecclimd1，lane6:limd1-a使用消化线性dna的酶(atp-dnase)处理，lane7:ecclimd1使用消化线性dna的酶(atp-dnase)处理，lane8:limd1-a序列使用内切酶hincⅱ和bsai进行酶切处理，lane9:ecclimd1经atp-dnase、hincⅱ和bsai进行酶切处理。

20、dna环接头处进行测序处理，结果如图3所示。该方法能通过简单的pcr反应进行快速成环，效率高，成本低。

21、目前的成环方法有crispr-c方法和t4 dna连接酶方法，crispr-c可以从基因间和基因位点生成eccdna，大小范围从几百个碱基对到207kb不等，但这种方法需要一个特定的基因编辑系统，耗时且复杂。t4 dna连接酶将hindⅲ粘性末端的dna自连接成环，这种连接反应需要0.1-10nm范围内的非常低的dna浓度来抑制分子间连接，因此产量非常低。本发明通过pcr方法快速构建环状dna，且浓度高，为研究具体eccdna的功能和分子机制提供了有利技术支撑。