黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度荧光定量PCR检测方法

本发明涉及生物，具体而言，本发明涉及一种黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度荧光定量pcr检测方法。

背景技术：

1、黄曲霉毒素(afaltoxins，aft)主要是由真菌黄曲霉(aspergilus flavus)、寄生曲霉(a.parasiticus)和集蜂曲霉(a.nonius)产生的次级代谢产物，具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用，广泛存在于花生、玉米、麦类、稻谷等农产品中，在通心粉、调味品、牛奶和食用油中也有发现，严重危害人、畜、禽类健康。黄曲霉毒素主要包括b1,b2,g1,g2,m1,m2,gm,p1,q1以及毒醇等。在天然污染样品中，以b1污染最多，且b1的毒性最大，致癌性最强。1993年，黄曲霉毒素被世界卫生组织(who)的癌症研究机构划定为i类致癌物，全球每年约有25％的农作物遭受病菌及其毒素的污染，约有2％的农作物因污染严重而失去营养和经济价值。因此，黄曲霉毒素的检测方法一直是国内外研究的焦点。目前，针对黄曲霉毒素的常规检测方法主要有胶体金检测法、酶联免疫法、荧光免疫法等以抗原抗体反应为基础的免疫学检测方法，通常应用于黄曲霉毒素的筛查；精确定量的检测方法主要以液相色谱、液相色谱串联质谱等基于高端检测设备为基础的仪器检测方法，这些检测方法费时、费力、操作复杂、成本高。

2、粮食及食品中黄曲霉毒素主要由黄曲霉(a.flavus)产生，而寄生曲霉(a.parasiticus)及集蜂曲霉(a.nonius)罕见。据研究，自然界中只有10％黄曲霉菌株能够产生黄曲霉毒素。因此，黄曲霉产毒菌株的检测对于黄曲霉毒素污染风险预警具有重要意义，同时能够节约黄曲霉毒素检测成本，但是目前对产黄曲霉毒素菌株检测的方法较少。据报道，aflo、afld和aflp基因是黄曲霉毒素b1合成过程中的关键基因，这三个基因表达的菌株经hplc检测都是产黄曲霉毒素菌株，因此可以通过检测这三个基因的表达推断被检菌株是否是产毒菌株或其是否具有产毒的可能性，为快速、准确地判断被检样品中黄曲霉毒素潜在污染风险。

3、

技术实现思路

1、基于此，本研究以黄曲霉菌产毒关键基因afld为检测目标，设计特异性引物；并直接以黄曲霉菌孢子提取的总dna为模板，利用实时荧光定量pcr技术检测花生中黄曲霉菌产毒菌株，以样品荧光定量ct值与黄曲霉菌株孢子浓度建立关系模型，以推测黄曲霉毒素潜在污染风险。

2、本发明提供一种检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度的荧光定量pcr引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸组成。

3、本发明还提供一种检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度的荧光定量pcr试剂盒，包括权利要求1所述的荧光定量pcr引物组。

4、所述试剂盒中还包括pcr反应试剂。

5、上述的荧光定量pcr引物组以及所述的试剂盒在检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度中的应用也属于本发明的保护范围。

6、本发明提供的检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度的荧光定量pcr方法，包括下述步骤：

7、1)将待测样品用水悬浮获得孢子悬浮液；

8、2)提取待测样品dna；

9、3)以待测样品dna为模板，用权利要求1所述的荧光定量pcr引物组进行荧光定量pcr检测，获得ct值；

10、4)将步骤3)获得的ct值代入步骤1)获得的黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度与ct值线性曲线y＝-2.7406x+48.722，其中，y为荧光定量pcr ct值，x＝lga,其中a为黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度，单位为个/ml，换算得到待测样品孢子悬浮液中黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度。

11、其中，所述荧光定量pcr的反应体系为20μl体系，包括dna模板1μl，序列表中序列1所示引物(10μm)0.4μl，序列表中序列2所示引物(10μm)0.4μl,mix 10μl,ddh2o 8.2μl。。

12、所述荧光定量pcr的反应程序为：先95℃2min，然后95℃，10s，62.5℃30s，40个循环，最后95℃15s，60℃1min，95℃1s。

13、所述步骤2中，提取待测样品dna的方法为待测样品孢子悬浮液于1.5ml离心管内，于离心机中在12000rpm离心15min后，去掉上清。将孢子沉淀以液氮冷冻，研磨，加200μlddh2o于离心管内，置于沸水中9min，14000r，4℃，15min，所得上清即为黄曲霉菌孢子dna溶液。

14、步骤1)中，获得待测样品孢子悬浮液的方法是用水与样品混匀，震荡混匀获得黄曲霉菌产毒菌株孢子悬浮液。

15、所述步骤1)中，还包括将获得的黄曲霉菌产毒菌株孢子悬浮液转移置于50ml离心管中震荡混匀3min；将离心管中混匀后的孢子悬浮液用灭菌后的脱脂棉过滤去掉培养基等其他物质，然后用5mlddh2o/rnase-free water冲洗脱脂棉，得到纯净的孢子悬浮液，于离心机中在12000rpm离心15min后，去掉上清，加入1mlddh2o/rnase-free water浓缩孢子悬浮液。

16、本发明的方法操作简单快速，特异性强，稳定性好，灵敏度高，适合大批量检测。

技术特征：

1.一种检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度的荧光定量pcr引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸组成。

2.一种检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度的荧光定量pcr试剂盒，包括权利要求1所述的荧光定量pcr引物组。

3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括pcr反应试剂。

4.权利要求1所述的荧光定量pcr引物组以及权利要求2或3所述的试剂盒在检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度中的应用。

5.一种检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度的荧光定量pcr方法，包括下述步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光定量pcr的反应体系为20μl体系，包括dna模板1μl，10μm序列表中序列1所示引物0.4μl，10μm序列表中序列2所示引物0.4μl,mix 10μl,ddh2o 8.2μl。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2中，提取待测样品dna的方法为待测样品孢子悬浮液于1.5ml离心管内，于离心机中在12000rpm离心15min后，去掉上清；将孢子沉淀以液氮冷冻，研磨，加200μlddh2o于离心管内，置于沸水中9min,14000r，4℃，离心15min，所得上清即为黄曲霉菌孢子dna溶液。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤1)中，获得待测样品孢子悬浮液的方法是用水与样品混匀，震荡混匀获得黄曲霉菌产毒菌株孢子悬浮液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，还包括将获得的黄曲霉菌产毒菌株孢子悬浮液转移置于50ml离心管中震荡混匀3min；将离心管中混匀后的孢子悬浮液用灭菌后的脱脂棉过滤去掉培养基等其他物质，然后用5mlddh2o冲洗脱脂棉，得到纯净的孢子悬浮液，于离心机中在12000rpm离心15min后，去掉上清，加入1ml ddh2o浓缩孢子悬浮液。

技术总结
本发明公开了黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度荧光定量PCR检测方法。该方法中，检测黄曲霉菌产毒菌株孢子浓度的荧光定量PCR引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸和序列表中序列2所示的核苷酸组成。本研究建立的检测方法操作简单快速，特异性强，稳定性好，灵敏度高，适合大批量检测。

技术研发人员：张兰,刘新刚,付瑞强,张燕宁,毛连纲,朱丽珍,蒋红云
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11