一类多羟基环己烷衍生物及其制备方法和应用

本发明涉及海洋真菌活性成分分析，具体涉及从附球菌属真菌(epicoccum sorghinum)gst-5中提取获得的gabosine和chlorogentisyl alcohol衍生物及其应用。

背景技术：

1、海洋微生物相对于陆地微生物而言，能够耐受海洋特有的如高盐、高压、低氧、低光照等极端条件，生活环境的特异性导致海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上的多样性。海洋环境的特殊性加上海洋微生物资源获取技术的进步又给海洋微生物源天然药源化合物的研究带了前所未有的机遇。

2、海洋微生物中的海洋真菌是活性次级代谢产物的丰富的来源，海洋真菌的次级代谢产物70-80％具有生物活性，包括小分子内脂化合物；真菌毒素；对中枢神经系统有抑制活性的新物质；1-十二醇、不饱和烃、酸、酯；可抑制植物和人的真菌病毒作用于真菌细胞壁合成新靶位的脂肽类抗生素。以海洋真菌为原料发现具有特定结构类型的天然产物对于海洋药物的研发具有重要意义。

3、β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase，gus)是肠道菌群产生的一类重要的水解酶，其可催化葡萄糖醛酸结合物发生水解反应并生成相应的苷元。在人体内，肠道中分布的gus还可催化多种药物(如吲哚美辛、双氯芬酸及伊立替康的活性产物7-乙基-10-羟基喜树碱)及内源性激素的葡萄糖醛酸苷水解，释放出的苷元可被肠道再次吸收，从而形成药代动力学上的双峰现象。值得注意的是，该过程有可能引发严重的胃肠不良反应，例如，gus可催化7-乙基-10-羟基喜树碱-o-葡萄糖醛酸(sn-38g)的水解并生成具有强细胞毒作用的产物sn-38，而后者在肠道中累积可引发肠黏膜脱落并导致严重的迟发型腹泻等不良反应。因此，研发高效安全的gus抑制剂对缓解伊立替康、吲哚美辛等药物引起的致死性腹泻有重要意义(翁仔淼，吕珊珊，葛广波，王平，侯洁，药学进展，肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂的研究进展，2018，42(03))。

4、目前关于附球菌属真菌(epicoccum)的化学成分研究较少。郝宝聪等从一株蒲公英内生真菌epicoccum sorghinum中分离得到(4r*，5r*，6s*)-4，5-二羟基-6-(6′-甲基水杨酸氧基)-2-甲氧基甲基-2-环己烯-1-酮、(4r*，5r*，6s*)-4，5-二羟基-6-(6′-甲基水杨酸氧基)-2-甲基-2-环己烯-1-酮、(4r，5r，6s)-4，5-二羟基-6-(6′-甲基水杨酸氧基)-2-羟基甲基-2-环己烯-1-酮、(-)-gabosine e、theobroxide、3-氯代龙胆醇和3-羟基苯甲醇(郝宝聪，郑瑶瑶，陈旭，陈秋霞，季若男，陈敏，药学学报，一株蒲公英内生真菌epicoccumsorghinum 1-2次级代谢产物研究，2022，57(07))。

5、元超等对分离自地衣leptogium masiaticum的一株内生真菌黑附球菌epicoccumnigrum 14one的化学成分进行研究，分别鉴定为1个生物碱化合物fusaricide，7个苯并呋喃类化合物epicoccone b，4，6-dihydroxy-5-methoxy-7-methyl-1，3-dihydroisobenzofuran，5-methyl-epicoccone b，3，6，7-trihydroxy-5-methoxy-4-methylisobenzo furan-1(3h)-one，3-methoxyepicoccone b，2，3，4-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-methylbenzyl-alcohol，isoochracinic acid和3个epicoccolide类化合物epicocconigrones a，epicoccolide b，epicocconigrones b，其中生物碱fusaricide和epicoccolide类化合物具有很强的抗菌活性，其中生物碱fusaricide对肺癌细胞m109具有较好的体外抑制活性(元超，郭玉华，张影波，胡璇，王丹，于福来，李刚，中国中药杂志，一株植物内生真菌epicoccum nigrum 14one次生代谢产物研究，2019，44(18)，4021-4025)。

6、但是迄今还未查到有文献报道从附球菌属真菌中分离得到抗gus酶的chlorogentisyl alcohol及gabosine化合物。

技术实现思路

1、本发明的目的在于从海洋附球菌属真菌(epicoccum)中提取获得具有药用价值的天然活性物质。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明从附球菌属真菌(epicoccum sorghinum)gst-5的发酵产物中分离得到25种化合物，经结构鉴定，25种化合物为多羟基环己烷衍生物，分别属于chlorogentisylalcohol衍生物(具有2-氯-6-(羟基甲基)苯-1，4-二酚结构)、gabosine衍生物(具有4，5，6-三羟基-2-(羟基甲基)环己-2-烯-1-酮结构)以及具有chlorogentisyl alcohol和gabosine杂合骨架的衍生物，具体结构式如图1所示，分别编号为1～25。

4、所述附球菌属真菌(epicoccum sorghinum)gst-5分离自台湾省龟山岛海底热液口沉积物的大型海洋植物，保藏号为：cgmcc 3.20238。

5、本发明通过查阅数据库和文献，鉴定上述25种化合物中有19种为新化合物，因此，本发明提供了一类新的chlorogentisyl alcohol衍生物、gabosine衍生物或具有chlorogentisyl alcohol和gabosine杂合骨架的衍生物，其中chlorogentisyl alcohol衍生物的结构式如式(4)-(6)、(13)-(15)中任一个所示，分别对应化合物4、5、6、13、14、15。

6、

7、

8、其中，gabosine衍生物的结构式如式(8)、(20)、(24)-(25)中任一个所示，分别对应化合物8、20、21、22、24、25。

9、

10、其中，具有chlorogentisyl alcohol和gabosine杂合骨架的衍生物的结构式如式(7)、(9)、(16)、(17)中任一个所示，分别对应化合物7、9、10、11、12、16、17。

11、

12、本发明还提供了一种从附球菌属真菌(epicoccum sorghinum)gst-5的发酵产物中分离提取上述新化合物的方法，但本发明中上述化合物的制备方法并不局限于此。

13、从发酵产物中提取所述chlorogentisyl alcohol衍生物、gabosine衍生物或具有chlorogentisyl alcohol和gabosine杂合骨架的衍生物的方法，包括以下步骤：

14、(1)将附球菌属真菌(epicoccum sorghinum)gst-5经活化后接种于液体培养基中，进行发酵培养；

15、(2)发酵培养结束后，分离得到菌丝体和发酵液，菌丝体中加入有机溶剂中浸提，分离得到浸提液，浸提液浓缩后用蒸馏水混悬，得到水混悬液，再用乙酸乙酯或正丁醇对水混悬液进行萃取，得到萃取液a；发酵液与硅藻土搅拌后，采用乙酸乙酯或正丁醇回流进行萃取，得到萃取液b；

16、(3)将萃取液a或萃取液b浓缩后进行正相硅胶柱层析分离，依次以体积比100:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1的二氯甲烷/甲醇混合液进行梯度洗脱，收集体积比10:1的二氯甲烷/甲醇混合液洗脱出的馏分，再进行反相硅胶柱层析及高效液相色谱分离制得所述衍生物。

17、步骤(1)中，对附球菌属真菌(epicoccum sorghinum)gst-5进行发酵培养。

18、附球菌属真菌gst-5为真菌，采用常规的pda液体培养基或麦芽汁培养基即可用于发酵培养。为了增加产量，给微生物生长代谢提供足够的营养成分，优选地，以体积1l计，所述液体培养基包括以下原料：淀粉1-5g、麸皮10-20g、酵母膏3-15g、kh2po4 1-8g，mgso4·7h2o 0.1-0.8g，余量为水；

19、或者，以体积1l计，所述液体培养基包括以下原料：马铃薯200-600g、蛋白胨2-10g、酵母膏1-5g、葡萄糖5-20g、余量为水；培养液初始ph值为6.0-7.0；

20、或者，以体积1l计，所述液体培养基包括以下原料：蔗糖10-40g、玉米粉5-20g、nano31-4g、酵母膏1-4g、kh2po4 0.2-0.8g、mgso4·7h2o 0.2-1g、kcl 0.2-1g、feso4 0.001-0.005g，余量为水；

21、或者，以体积1l计，所述液体培养基包括以下原料：麦芽浸粉20-30g、葡萄糖15-20g、酪蛋白胨1-2g，余量为水。

22、发酵培养的条件为20-30℃静态培养10-40天。所述静态培养方式即不进行摇瓶培养。

23、优选的，发酵培养的温度为22-26℃。更优选为25℃培养20天，该条件下所述chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物的产量最高。

24、步骤(2)中，分离获得菌丝体和发酵液，所述的菌丝体和发酵液中均能提取分离得到所述chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物。

25、其中，利用菌丝体获取chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物时，将菌丝体置于有机溶剂中浸泡7-14天，菌丝体充分破壁，使胞内物质有效溶出。所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮中的一种或两种。

26、步骤(3)中，分离纯化方法为：对萃取液进行正相硅胶柱层析分离，所得馏分再进行重结晶、反相硅胶柱层析、高效液相色谱分离。通过多步分离纯化，能获得纯度较高的chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物。

27、优选的，所述馏分进行反相硅胶柱层析，依次以体积比1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的甲醇/水混合液进行梯度洗脱，每个梯度洗脱5次，依次编号1～45，将编号为1～3的馏分合并为亚组分1，馏分4～5合并为亚组分2，馏分14～17合并为亚组分6，馏分18～25合并为亚组分7，馏分26～28合并为亚组分8，馏分38～39合并为亚组分12；继而用高效液相色谱分离，亚组分1在体积比28％的甲醇/水混合液洗脱下，保留时间为25.6分钟的峰为结构式如式(20)所示r1＝cl，r2＝ch3的化合物20；亚组分2在体积比35％的甲醇/水混合液洗脱下，保留时间分别为29.3分钟，24.5分钟，35.6分钟，36.9分钟的峰为化合物4，5，21和22，结构式分别如式(4)、式(5)、式(20)r1＝oxybutyl，r2＝h、式(20)r1＝oh，r2＝oxybutyl所示；亚组分6在体积比为36％的甲醇/水混合液洗脱下，保留时间分别为23.3分钟，25.5分钟，30.6分钟的峰为化合物6，7和8，结构式分别如式(6)、式(7)、式(8)所示；亚组分7在体积比为42％的甲醇/水混合液洗脱下，保留时间分别为18.2分钟，24.4分钟，26.9分钟，22.3分钟的峰为结构式如式(9)所示的化合物9，11，12和10；亚组分8在体积比为18％乙腈/水混合液洗脱下，保留时间分别为15.2分钟，17.5分钟，19.6分钟，23.3分钟，26.3分钟的峰为化合物13，14，15，16和17，结构式分别如式(13)、式(14)、式(15)、式(16)、式(17)所示；亚组分12在体积比为25％的乙腈/水混合液洗脱下，保留时间分别为14.3分钟，18.3分钟的峰为化合物24和25，结构式分别如式(24)、式(25)所示。

28、本发明研究表明，利用上述方法从附球菌属真菌gst-5(epicoccumsorghinum.gst-5)发酵培养物中分离得到的chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物具有较好的抗β-葡萄糖醛酸苷酶(gus)活性，进一步的，本发明以化合物对细胞的抑制活性作为其细胞毒性数据，结果表明，除化合物12、14，其他化合物对人体细胞毒性低。因此，本发明提供了所述的多羟基环己烷衍生物在制备抗β-葡萄糖醛酸苷酶的药物或功能食品中的应用。

29、进一步的，所述抗β-葡萄糖醛酸苷酶药物为肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂。研究表明，肠道中分布的β-葡萄糖醛酸苷酶在催化药物(如吲哚美辛、伊立替康等)水解过程中会引发胃肠不良反应。本发明提供的化合物可通过抑制gus酶活性，进而缓解药物引发的胃肠不良反应。

30、本发明提供了所述的多羟基环己烷衍生物在制备缓解伊立替康、吲哚美辛药物引起的胃肠毒副反应的药物或功能食品中的应用。

31、进一步的，本发明研究发现，化合物12、14对namalwa细胞株和u266细胞株具有显著抑制效果，因此，本发明提供了结构式如式(12)、(14)所示的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。具体的，所述肿瘤为骨髓瘤或淋巴瘤。

32、

33、进一步的，上述25种化合物中结构式如式(1)、(3)、(18)、(19)、(23)所示的化合物为已知化合物，分别对应化合物1、2、3、18、19、23。本发明研究表明，所述化合物同样具有抗gus酶活性，因此，本发明提供了结构式如式(1)、(3)、(18)、(19)、(23)所示的化合物在制备抗β-葡萄糖醛酸苷酶的药物或功能食品中的应用。进一步的，抗β-葡萄糖醛酸苷酶药物为肠道菌β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂。

34、

35、

36、所述药物以本发明的chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物为主要活性成分，添加药剂学上可接受的辅料制成，可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。所述的制剂可以为注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、口含剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸等。

37、所述功能食品以本发明的chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物为主要活性成分，添加可接受的食品辅料制成。

38、本发明还提供了一种从附球菌属真菌(epicoccum sorghinum)gst-5的发酵产物中分离提取化合物1、2、3、18、19、23的方法，包括以下步骤：将上述亚组分1、亚组分2、亚组分6进行高效液相色谱分离，具体的：亚组分1在体积比28％的甲醇/水混合液洗脱下，保留时间分别为13.1分钟，15.1分钟，18.3分钟，20.8分钟的峰为化合物1，2，3和19；亚组分2在体积比35％的甲醇/水混合液洗脱下，保留时间为27.3分钟的峰为化合物23；亚组分6在体积比为36％的甲醇/水混合液洗脱下，保留时间为33.3分钟的峰为化合物18。

39、本发明具备的有益效果：

40、(1)本发明利用chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物的极性差异从海洋真菌的发酵培养物中提取、分离获得了一种具有新颖结构的chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物，该方法操作简便、提取得率高、产物纯度高，适合规模化生产。

41、(2)通过体外抗gus酶试验，表明本发明提供的chlorogentisyl alcohol及gabosine衍生物具有较好的抗gus酶活性，其中活性最强的化合物17的ic50值为0.24μm。进一步的细胞毒性试验，表明本发明提供的碳糖化合物细胞毒性低，在制备抗gus酶的药物和预防保健食品方面具有良好的开发前景。

42、(3)通过体外肿瘤细胞试验，采用的肿瘤细胞株为namalwa细胞和u266细胞，其中化合物12对namalwa细胞的生存率为-0.33％，化合物14的对u266细胞的生存率为7.86％，接近阳性药物5-fu，在制备抗肿瘤的药物和预防保健食品方面具有良好的开发前景。