CREPT突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用

本发明涉及分子生物学领域，更具体而言，涉及crept蛋白的s134a突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用。

背景技术：

1、细胞周期的不同阶段的转换是多种蛋白调控的结果，其中最重要的调控蛋白是cdk(cyclin-dependent kinase)，这是一类在细胞分裂的不同时期处于不同活性状态的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。当这些激酶处于激活状态时，可以磷酸化下游底物去调节细胞周期，细胞分裂的不同时期需要不同表达水平的cyclin。cyclin d1/2/3和cdk4/6复合物的形成是细胞进入g1期所必须的。cyclin e与cdk2复合物的形成决定细胞是否可以通过g1期进入s期。cyclin a与cdk2的结合是细胞处于s期所必须的。在g2期末期和m期初期，cyclin a与cdk1的结合是促进细胞完成g2-m期转换所必需的。细胞进入m期后，cyclin b1与cdk1的结合又是必需的。在m期后期，cyclin b1的降解又是细胞离开m期进入下一个g1期所必需的。

2、细胞周期与肿瘤发生密切相关，研究人员在寻找肿瘤相关基因的研究中发现了一种新的肿瘤相关基因crept(cell-cycle related and expression-elevated protein intumor，专利号zl200510135513.4)。该基因能够和转录中的关键酶——rna聚合酶ii在细胞周期蛋白cyclin d1基因上结合，并且使cyclin d1基因形成环状结构，而这种环状结构的形成可能会促进基因的转录。crept是一种细胞周期正向调控蛋白，其在多种真核生物(例如人、酵母、小鼠、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥)中均存在且十分保守；而且研究人员已证实crept蛋白在多种肿瘤细胞和肿瘤组织中呈现高表达(li et al.,2021；lu etal.,2012)。

3、然而，crept具体如何参与细胞周期的调控作用尚不清楚。

技术实现思路

1、发明人发现，人crept蛋白的第134位残基的磷酸化状态对于细胞的生长和细胞周期调控有非常重要的作用，进而发现crept蛋白的s134a突变体不可磷酸化，能够抑制真核细胞增殖和迁移、抑制肿瘤的生长和转移并能够使癌细胞死亡，由此完成了本发明。

2、在本发明的第一方面，提供一种将野生型人crept的氨基酸序列(seq id no:4)的第134位残基替换为不可磷酸化残基而得到的蛋白。在一个实施方式中，所述不可磷酸化残基为丙氨酸或谷氨酰胺。在一个实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列为seq id no:2(下文中简称为“crept s134a”)。在一个实施方式中，所述蛋白通过将人crept的第134位的丝氨酸变为丙氨酸而得到。

3、本发明还提供一种蛋白，其与上述任一蛋白具有75％以上的序列同一性，且在对应于seq id no:4第134位的位点处的残基为所述不可磷酸化残基。

4、本发明还提供在上述任一实施方式所述的蛋白的n端和/或c端连接有标签序列或引导序列的蛋白。

5、本发明还提供编码上述上述任一蛋白的核酸。在一个实施方式中，所述核酸的序列为seq id no:1。

6、本发明还提供包含所述核酸的载体和包含所述载体的细胞。

7、在本发明的第二方面，提供上述蛋白、核酸或载体在制备抑制真核细胞的增殖和/或迁移的试剂中的应用。在一个实施方式中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。

8、在本发明的第三方面，提供上述蛋白、核酸或载体在制备抗癌药中的应用。在一个实施方式中，所述抗癌药包括抑制癌细胞增殖的药物、抑制癌细胞转移的药物或杀死癌细胞的药物。在一个实施方式中，所述癌是黑色素瘤、肝癌、肾癌、胃癌或结直肠癌(例如结肠癌)。在一个实施方式中，所述抗癌药还包括小分子抗癌剂和/或抗体抗癌剂。

9、在本发明的第四方面，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的上述蛋白、核酸或载体；或者，所述方法包括利用基于crispr/cas9的基因编辑技术编辑受试者癌细胞基因组中的crpet基因，以使所述癌细胞表达任一种上述蛋白。在一个实施方式中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。在一个实施方式中，所述癌症是黑色素瘤、肝癌、肾癌、胃癌或结直肠癌。在一个实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用小分子抗癌剂和/或抗体抗癌剂。在一个实施方式中，所述方法还包括对所述受试者进行放疗和/或化疗。在一个实施方式中，所述方法还包括：在向受试者施用有效量的所述蛋白、核酸或载体之前、过程中或之后，降低或消除受试者的癌细胞中的野生型crept的表达。

10、在本发明的第五方面，提供一种鉴定物质是否为crept蛋白的s134位点的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述抑制剂使crept蛋白的s134位点在真核细胞中保持持续非磷酸化状态；所述crept蛋白的氨基酸序列为seq id no:4，所述方法包括：s1)用待鉴定的物质处理表达crept蛋白的真核细胞；s2)用抗磷酸化抗体进行免疫沉淀来检查步骤s1中经处理的细胞中的crept蛋白的s134位点的磷酸化水平；与未经所述物质处理的对照细胞中crept蛋白的s134位点的磷酸化水平相比，如果经所述物质处理的细胞中的crept蛋白的s134位点的磷酸化水平下降，例如下降10％以上、20％以上、30％以上或40％以上，则将所述物质鉴定为crept蛋白的s134位点的磷酸化抑制剂，否则将所述物质鉴定为不是crept蛋白的s134位点的磷酸化抑制剂。在一个实施方式中，在步骤s1之前，所述方法包括：使用预测工具swisstargetprediction和sea针对crept来设计所述待鉴定的物质。在一个实施方式中，步骤s1通过在允许磷酸化的条件下温育所述待鉴定的物质和所述真核细胞来进行。在一个实施方式中，步骤s2包括用识别crept蛋白的抗crept抗体和识别crept蛋白134位点的磷酸化的抗磷酸化抗体来进行免疫沉淀，由此对crept蛋白的s134位点的磷酸化水平进行定量。在一个实施方式中，磷酸化水平是s134磷酸化的蛋白的量与crept蛋白总量的相对值。

技术特征：

1.一种将seq id no:4的第134位残基替换为不可磷酸化残基而得到的蛋白。

2.如权利要求1所述的蛋白，其中，所述不可磷酸化残基为丙氨酸或谷氨酰胺。

3.如权利要求1所述的蛋白，其氨基酸序列如seq id no:2所示。

4.如权利要求3所述的蛋白，其通过将人crept蛋白的第134位的丝氨酸变为丙氨酸而得到。

5.一种蛋白，其与权利要求1至4中任一项所述的蛋白具有75％以上的序列同一性，且在对应于seq id no:4第134位的位点处的残基为所述不可磷酸化残基。

6.在权利要求1至5中任一项所述的蛋白的n端和/或c端连接有标签序列或引导序列的蛋白。

7.编码权利要求1至6中任一项所述的蛋白的核酸。

8.如权利要求7所述的核酸，其序列为seq id no:1。

9.包含权利要求7或8所述的核酸的表达载体。

10.包含权利要求9所述的载体的细胞。

11.权利要求1至6中任一项所述的蛋白、权利要求7或8所述的核酸或权利要求9所述的载体在制备抑制真核细胞的增殖和/或迁移的试剂中的应用。

12.如权利要求11所述的应用，其中，所述真核细胞是人、酵母、小鼠、鸡、蟾蜍、斑马鱼、果蝇、线虫或拟南芥的细胞，优选人细胞，更优选人癌细胞。

13.权利要求1至6中任一项所述的蛋白、权利要求7或8所述的核酸或权利要求9所述的载体在制备抗癌药中的应用。

14.如权利要求13所述的应用，其中，所述抗癌药包括抑制癌细胞增殖的药物、抑制癌细胞转移的药物或杀死癌细胞的药物。

15.如权利要求13所述的应用，其中，所述癌是黑色素瘤、肝癌、肾癌、胃癌或结直肠癌。

16.如权利要求13所述的应用，其中，所述抗癌药还包括小分子抗癌剂和/或抗体抗癌剂。

17.一种治疗癌症的方法，所述方法包括：

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。

19.如权利要求17所述的方法，其还包括向所述受试者施用小分子抗癌剂和/或抗体抗癌剂。

20.如权利要求17所述的方法，其还包括对所述受试者进行放疗和/或化疗。

21.如权利要求17所述的方法，其中，所述i)还包括：在向受试者施用有效量的所述蛋白、核酸或载体之前、过程中或之后，降低或消除受试者的癌细胞中的野生型crept的表达。

22.如权利要求17所述的方法，其中，所述癌是黑色素瘤、肝癌、肾癌、胃癌或结直肠癌。

23.一种鉴定物质是否为crept蛋白的s134位点的磷酸化抑制剂的方法，其中，所述抑制剂使crept蛋白的s134位点在真核细胞中保持持续非磷酸化状态；所述crept蛋白的氨基酸序列为seq id no:4，所述方法包括：

24.如权利要求23所述的方法，其中，在步骤s1之前，所述方法还包括：使用预测工具swisstargetprediction和sea针对crept来设计所述待鉴定的物质。

25.如权利要求23所述的方法，其中，步骤s1通过在允许磷酸化的条件下温育所述待鉴定的物质和所述真核细胞来进行。

26.如权利要求23所述的方法，其中，步骤s2包括用识别crept蛋白的抗crept抗体和识别crept蛋白134位点的磷酸化的抗磷酸化抗体来进行免疫沉淀，由此对crept蛋白的s134位点的磷酸化水平进行定量。

技术总结
本发明涉及一种CREPT突变体及其在抑制肿瘤生长中的应用。具体而言，本发明涉及一种将SEQ ID NO:4的第134位残基替换为不可磷酸化残基而得到的蛋白、编码该蛋白的核酸、包含该核酸的载体和细胞，以及所述蛋白、核酸或载体在制备抑制真核细胞的增殖和/或迁移的试剂以及抗癌药中的应用。本发明还涉及一种治疗癌症的方法和一种鉴定物质是否为CREPT蛋白的S134位点的磷酸化抑制剂的方法。

技术研发人员：常智杰,任芳丽,王银银,褚君
受保护的技术使用者：清华大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11