一种用于生产制备9-OHAD的基因工程菌株、及其制备方法和应用

本发明属于生物技术和生物化工领域，具体涉及一种高产9α-羟基雄甾4-烯-3,17-二酮菌株、及其制备方法和应用。

背景技术：

1、类固醇药物是仅次于抗生素的第二大类药物，在预防和临床应用各种疾病如免疫系统疾病、风湿病、肿瘤和炎症方面发挥至关重要的作用。放线菌在利用与代谢异型生物质时表现出明显的天然优势，例如分枝杆菌可以利用天然甾醇或一些其他甾体化合物作为唯一的碳和能源。分枝杆菌关于植物甾醇分解代谢途径的中断会导致一些重要中间体的过度积累，如9-ohad、ad、ba等，可用作生产甾体激素药物的前体。

2、9α羟基雄烯二酮(9α-hydroxy androstenedione,简称9-ohad)是糖皮质激素药物合成工业化生产中的重要的中间体，由于特有的9α羟基的存在，比较容易与c11位进行脱氢生成c9,11-脱氢甾体，更有利于在c9位置引入9α-卤代-11β-羟基化甾体。9-ohad常用于合成氢化可的松、地塞米松、倍他米松、曲安西龙等多种甾体原料药，临床上常被作为抗性激素，皮质激素与避孕功能药物使用，具有重要的商业价值。9-ohad可以通过两种微生物转化方式从类固醇中获得。一种方法是羟基被具有羟基化功能的微生物直接引入ad的c9位置。例如，mycobacterium neoaurum jc-12和mycobacterium sp.vkmac-1817d的3-酮甾体9α-羟化酶(kshab)在枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中共表达，实现了ad到9-ohad的有效转化。然而，由于ksh羟化酶的低活性、ad的疏水性及其对细胞的毒性等，ad的低剂量限制了其大规模应用。另一种方法是将廉价的植物甾醇直接转化为9-ohad，由于其简单的分离过程和经济高效的生产方式而成为研究热点。尽管许多微生物可以将甾醇转化为9-ohad，但仍存在一些缺陷。例如，副产物的积累、植物甾醇的利用率低以及产品的降解等，严重限制了这些菌株的工业应用。

3、微生物转化植物甾醇积累9-ohad极易受到3-甾酮-△1-脱氢酶(3-ketosteroid-δ1-dehydrogenase，简称kstd)活性的影响。由于kstd的存在，9α-羟基引入甾体多杂环结构会形成极不稳定的9-ohadd，这触发甾体b环的断裂，从而c9羟基类固醇被微生物完全降解。另一方面，由于代谢途径的复杂性，c22代谢途径和c19代谢途径经常共存于放线菌中，因此在植物甾醇的转化过程中会同时积累c19和c22代谢物。例如mycobacteriumsp.vkmac-1817d可以有效地将谷甾醇转化为9-ohad，同时产生一些副产物，如ad、9-ohhp、9,24-dhc等。这些有相似结构的副产物不仅阻碍了9-ohad的纯化和精制过程，而且显著降低了9-ohad的产率。在植物甾醇的代谢过程中，17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a和双作用还原酶mnopccr是连接c22代谢通路和c19代谢通路的两个重要的基因靶点。例如在m.neoaurium atcc 25795中敲除hsd4a和kstd后，c22中间体4-hp在植物甾醇的转化中得到稳定积累。此外，在m.neoaurium cctcc ab2019054代谢甾醇过程中，mnopccr的失活或过表达改变了ad和4-hp之间的代谢流。考虑到c9和c22途径的竞争性，抑制c22代谢通量可以减少c22副产物并增加9-ohad产量。因此，对hsd4a和mnopccr进行功能修饰以开发能够将植物甾醇转化为不含c22副产物的9-ohad生产菌株的策略是可行的。

4、目前微生物转化植物甾醇生产9-ohad存在的问题有菌株转化能力低，副产物种类多且存在降解，严重影响9-ohad的生产效益，因此亟需开发高效专一的生产菌株以满足生产需求。

技术实现思路

1、鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于生产制备9-ohad的基因工程菌株，用于解决现有菌株技术中转化能力低，副产物种类多的问题。相比9-ohad生产菌株的出发菌株，所述基因工程菌株中的3-甾酮-△1-脱氢酶的编码基因kstd1、kstd2、kstd3、kstd4和kstd5以及双功能还原酶opccr的编码基因被敲除；同时过表达17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a和侧链降解基因fade28-29；其中，所述9-ohad生产菌株的出发菌株为放线菌。本发明的基因工程菌株能稳定积累9-ohad。

2、优选地，所述的3-甾酮-△1-脱氢酶(kstd1、kstd2、kstd3、kstd4和kstd5)的编码基因具有seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示核酸序列，其中这五个基因的失活或敲除可以通过crispr或同源重组等常用技术手段实现。

3、优选的，所述双功能还原酶opccr的编码序列具有seq id no:8所示核苷酸序列或者与seq id no:8所示核苷酸序列同源性80％以上的序列，其中opccr基因的失活或敲除可以通过crispr或同源重组等常用技术手段实现。

4、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的基因工程菌中，所述的放线菌是分枝杆菌、诺卡氏菌、红球菌或节杆菌。作为本发明的某些实施方式，本发明所述的基因工程菌中，所述放线菌是偶发分枝杆菌mycobacterium fortuitum atcc 35855(atcc 35855)或mycobacteriumfortuitum atcc 6842(atcc 6842)。

5、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的基因工程菌中，所述基因工程菌中过表达的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶基因hsd4a和侧链降解基因fade28-29是重组了另一拷贝的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶基因hsd4a和侧链降解基因fade28-29。作为本发明的某些实施方式，所述重组了另一拷贝的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶基因hsd4a和侧链降解基因fade28-29其基因序列来自m.neoaurum dsm 44074。作为本发明的某些实施方式，所述过表达的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a基因序列如seq idno:7或其简并序列所示，所述过表达的侧链降解基因fade28-29基因序列如seq id no:10或其简并序列所示。优选的，所述17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a的编码序列具有seq id no:7所示核苷酸序列或者与seq id no:7所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列具有至少80％以上同源性的氨基酸序列。所述hsd4a可来源于分支杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。更优选的，hsd4a基因来源于新金分支杆菌m.neoaurum dsm 44074。

6、优选的，所述侧链降解相关基因fade28-29的编码序列具有seq id no:10所示核苷酸序列或者与seq id no:10所示核苷酸序列所编码的氨基酸序列具有至少80％以上同源性的氨基酸序列。所述fade28-29可来源于分支杆菌、红球菌、节杆菌或诺卡氏菌。更优选的，fade28-29基因来源于新金分支杆菌m.neoaurum dsm 44074。

7、作为本发明的某些实施方式，所述9-ohad生产菌株的出发菌株中的3-甾酮-△1-脱氢酶的编码基因kstd1、kstd2、kstd3、kstd4和kstd5其基因序列分别如seq id no:2-seqidno:6或其简并序列所示，所述9-ohad生产菌株的出发菌株中的双功能还原酶opccr的编码基因其基因序列如seq id no:8或其简并序列所示。

8、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种制备所述的基因工程菌的方法，所述方法是将偶发分枝杆菌mycobacterium fortuitum atcc 35855或mycobacteriumfortuitum atcc 6842基因组中3-甾酮-△1-脱氢酶的编码基因kstd1～5以及双功能还原酶opccr的编码基因失活，同时将17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a基因和侧链降解基因fade28-29过表达。

9、本发明采取解决9-ohad降解和降低副产物含量的方式实现了获得高产的9-ohad。在atcc 35855中全部敲除五个kstd实现9-ohad的稳定积累。通过敲除opccr以及过表达hsd4a降低了c22代谢通路的代谢流，减少了副产物9-ohhp的积累，通过过表达侧链代谢基因fade28-29降低了副产物9,24-dhc的含量。最终，改造后的偶发分枝杆菌9-ohad的产量达12.21g/l，摩尔产率为84.41％。

10、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的方法中，通过敲除所述3-甾酮-△1-脱氢酶的编码基因kstd1～5以及双功能还原酶opccr的编码基因使其失活。作为本发明的某些实施方式，通过crispr或同源重组敲除所述3-甾酮-△1-脱氢酶的编码基因kstd1～5以及双功能还原酶opccr的编码基因。

11、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的方法中，所述过表达17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a基因和侧链降解基因fade28-29是在所述偶发分枝杆菌mycobacteriumfortuitum atcc 35855或mycobacteriumfortuitum atcc 6842基因组中重组另一拷贝的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a基因和侧链降解基因fade28-29。

12、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的方法中，所述重组另一拷贝的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a基因和侧链降解基因fade28-29来源于m.neoaurumdsm44074。

13、作为本发明的某些实施方式，所述重组的17-羟基甾体/22-oh-bnc-coa脱氢酶hsd4a基因其核苷酸序列如seq id no:7或其简并序列所示，所述重组的侧链降解基因fade28-29其核苷酸序列如seq id no:10或其简并序列所示。

14、为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供所述的基因工程菌在发酵生产9-ohad中的应用。

15、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的应用中，所述发酵生产的发酵培养基含有玉米浆干粉10-20g/l，葡萄糖8-15g/l，磷酸氢二铵0.5-1g/l，硝酸钠5-8g/l，吐温801-3g/l，植物甾醇与羟丙基-β-环糊精的混合物10～30g/l。作为本发明的某些实施方式，所述发酵生产的发酵培养基含有玉米浆干粉15g/l，葡萄糖10g/l，磷酸氢二铵0.7g/l，硝酸钠6g/l，吐温80 2.0g/l，植物甾醇与羟丙基-β-环糊精按1:3质量比混合，ph为7.5。作为本发明的某些实施方式，所述发酵培养基含有按1:3质量比混合的植物甾醇与羟丙基-β-环糊精10g/l。

16、优选的，所述发酵培养基中的植物甾醇预先按照一定比例与羟丙基-β-环糊精混合搅拌并超声处理至均匀状态，然后添加到培养基中。更优选地，植物甾醇与羟丙基-β-环糊精的质量比为1:3。

17、作为本发明的某些实施方式，本发明所述的应用中，所述发酵生产的条件为发酵温度30℃-37℃，ph为7-8，发酵时间为4-6天。作为本发明的某些实施方式，所述发酵温度为30℃。作为本发明的某些实施方式，所述发酵的ph为7.5。作为本发明的某些实施方式，所述发酵时间为5天。

18、具体的应用和条件可以根据实际要求进行调整所述ba生产菌的发酵接种量，种子液浓度。作为本发明的某些实施方式，9-ohad生产菌种子液的od600为8-12，种子液体积为发酵培养液的10％-20％。作为本发明的某些实施方式，9-ohad生产菌种子液的od600为10。

19、如上所述，本发明的一种用于生产制备9-ohad的基因工程菌株、及其制备方法和应用，具有以下有益效果：

20、1、本发明提供的基因工程菌株能够稳定积累9-ohad产物，解决了发酵过程中9-ohad降解问题；

21、2、本发明提供的基因工程菌株同时降低了副产物9-ohhp和9,24-dhc的积累量，提高了9-ohad的产物纯度和产量；

22、3、实现了从植物甾醇出发，通过生物转化直接得到9-ohad，与atcc 35855相比，mf-fa5020的9-ohad产率提高了53.85％。而且20g/l植物甾醇在144小时内积累了12.21g/l的9-ohad，9-ohad的摩尔产率为83.68％。