一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体的制作方法

本发明涉及噬菌体领域，具体来说，涉及一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体。

背景技术：

1、养殖业随着产业的发展和深入，规模已经越来越大，畜禽在人们的生活中的需求加大催生了养殖业的蓬勃发展，养殖业的大面积养殖对传统的饲料供应提出了新的要求和高的标准。而随着农业农村部相关公告的指出，2020年7月1日起，饲料生产企业需要停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料，从而极大的提高了饲料作物无抗种植的重要性。

2、大豆和油菜是我国传统饲料作物，其产量及品质对我国畜牧养殖业具有极大的影响。黄单胞菌属于黄单胞菌科黄单胞菌属，革兰氏阴性菌，专性好氧，化能有机营养型植物病原菌。其中油菜黄单胞菌大豆致病变种[xanthomonas campestris pv.glycines(nakano)dye]是大豆细菌性斑疹病病原菌。野油菜黄单胞菌(x.campestris)是油菜黑腐病病原菌。

3、当前，相关技术中对于黄单胞菌引起植物细菌性疾病的防控技术，一方面是以化学防治为主，但从现有的防治情况来看，效果均不理想。另一方面，随着近年来国家在农作物上减抗、无抗的号召，国内外学者积极研究新兴的抗细菌生物制剂，由于黄单胞菌噬菌体具备对目标细菌的专一高效裂解能力，能显著降低环境中致病菌的数量，可控制或减少疾病的发生和流行。因此，噬菌体可作为抗细菌感染制剂使用，故本发明提出了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体。

技术实现思路

1、针对相关技术中的问题，本发明提出一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。

2、为此，本发明采用的具体技术方案如下：

3、一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，对于饲料作物源(如大豆，油菜等)黄单胞菌致病变种具有较强的裂解效果，应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体为黄单胞菌噬菌体xnjp8（xanthomonas sp.phage xnjp8），其于2022年03月17日被保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉武汉大学），保藏编号为cctcc no.m2022272。

4、进一步的，黄单胞菌噬菌体xnjp8为烈性噬菌体，有一呈多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径为45～60nm，尾部的长度为10～15nm，尾部直径为8～10nm，属于autographiviridae科噬菌体。

5、通过采用上述技术方案，从电镜中观察噬菌体的形貌，可知该噬菌体具有多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，有助于头部的核酸注入宿主菌中，还可有效识别宿主菌表面的特殊受体。

6、进一步的，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8具有seq id no.1所示的核苷酸序列。

7、进一步的，基因组测序组装结果显示，黄单胞菌噬菌体xnjp8基因组长度为44594bp，gc含量为62.4％。

8、进一步的，通过生物信息学软件对基因组进行注释，发现黄单胞菌噬菌体xnjp8的基因组上共编码55个蛋白，不编码trna基因，未发现已知的耐药基因和毒力基因。

9、进一步的，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8在感染复数moi＝0.00001条件下培养24h，效价达到6×1010pfu/ml以上。

10、感染复数(moi)是噬菌体数量与细菌数量的比值，是研究噬菌体感染细菌与产出噬菌体子代量效关系的重要依据。本发明的黄单胞菌噬菌体只需添加少量，即可侵染黄单胞菌增殖获得大量子代噬菌体。本发明为工业化生产噬菌体杀菌剂提供了优质噬菌体菌株来源。

11、进一步的，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8在ph＝4～11的条件下具有耐性，在48h内效价降低不超过1个数量级。

12、通过采用上述技术方案，可知在ph4或者ph11，即在酸性或者碱性条件下，本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8具有优异的耐性，当防治环境在ph＝4～11之间时，本发明的黄单胞菌噬菌体均可以起到有效的防治作用。

13、进一步的，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8经紫外辐射8h后，效价降低不超过1个数量级。

14、通过采用上述技术方案，当防治环境中紫外线较强时，采用本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8具有良好的耐受性，效价降低较少，能够对病原菌起到有效的防治作用。

15、根据本发明的另一个方面，提供了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体在制备冻干粉中的应用。

16、本发明的有益效果为：

17、1)本发明提供了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，在大豆，油菜等饲料作物生产过程中，利用噬菌体对相关细菌性病害进行防治，对于饲料作物源黄单胞菌致病变种具有较强的裂解效果，一方面可以减少因细菌性病害带来的经济损失，另一方面可以显著降低饲料作物生产过程中抗生素的使用，从饲料源头的减抗替抗来带动后续养殖业的减抗替抗。

18、2)本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8安全性高，可用作为制备试剂盒以及生物类消毒剂或生物类农药的有效成分，防治由黄单胞菌引起的饲料作物各类细菌性疾病。

19、3)本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8对紫外线、酸碱性环境具有较高的耐受性，适用于不同的防治环境中，能够对由黄单胞菌引起的饲料作物细菌性病害起到较好的生物防治效果。

20、4)本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8是从自然界中分离的烈性噬菌体，供试噬菌体不含毒力基因或不良基因，该噬菌体的dna无法编码可能引起潜在的健康风险的蛋白，不存在携带溶源基因的可能。

21、5)本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8为严格的烈性噬菌体，对宿主菌具有高度专一性和裂解性，并且具有较广的宿主范围，对49株不同地域来源的黄单胞菌的裂解率高达90％；黄单胞菌噬菌体xnjp8可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、灌溉设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性；所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、tsb培养基、lb培养基、氯游离水等。

22、6)本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8无法识别10株供试非致病性有益细菌中的任何一株，说明其特异性良好。

23、7)本发明的黄单胞菌噬菌体xnjp8可以作为一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体在制备冻干粉中的应用，且对由黄单胞菌引起的饲料作物细菌性病害具有较好的生物防治效果。

技术特征：

1.一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体为黄单胞菌噬菌体xnjp8，其于2022年03月17日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no.m2022272。

2.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8为烈性噬菌体，有一呈多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，属于autographiviridae科噬菌体。

3.根据权利要求2所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述头部直径为45～60nm，所述尾部的长度为10～15nm，所述尾部直径为8～10nm。

4.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8具有seq id no.1所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8基因组长度为44594bp，gc含量为62.4％。

6.根据权利要求5所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8的基因组上共编码55个蛋白，不编码trna基因，未发现已知的耐药基因和毒力基因。

7.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8在感染复数moi＝0.00001条件下培养24h，效价达到6×1010pfu/ml以上。

8.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8在ph＝4～11的条件下具有耐性，在48h内效价降低小于2个数量级。

9.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体xnjp8经紫外辐射8h后，效价降低小于1个数量级。

10.权利要求1所述的应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体在制备冻干粉中的应用。

技术总结
本发明公开了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，对于饲料作物源黄单胞菌致病变种具有较强的裂解效果，该应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体为黄单胞菌噬菌体XNJP8，其于2022年03月17日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2022272。本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8安全性高，可用作为制备试剂盒以及生物类消毒剂或生物类农药的有效成分，防治由黄单胞菌引起的饲料作物各类细菌性疾病。

技术研发人员：徐天舜,许文建,华雨田,肖逍,丁良,乔欢,何四龙,徐旭凌,丛郁
受保护的技术使用者：菲吉乐科（南京）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15