一种腹泻病毒多指标同检的嵌合引物、试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及分子生物，具体而言，涉及用于腹泻病毒多指标同检的引物、试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、腹泻病是一组多因素多病原引起的疾病，以大便次数多和大便性状改变为主要特点的一种常见疾病，是广泛关注的世界性公共卫生问题。大部分急性腹泻为感染性腹泻，作为公共卫生问题之一，是一类全球性的、危害大的传染性疾病，根据引起感染的病原体种类可以分为细菌性腹泻、寄生虫性腹泻和病毒性腹泻，大多数散发或暴发的急性腹泻是由病毒病原体引起的。

2、据who统计，全球每年约有20亿腹泻病例，较差的卫生状况导致发展中国家腹泻更为普遍。在我国，感染性腹泻在法定传染病中报告发病率位居前3位，90％以上的感染性腹泻是由病毒引起的。德国每年发生成人急性腹泻64900万例，每年约有7亿5岁以下儿童发生急性感染性腹泻。50％以上的婴幼儿腹泻是由常见的腹泻病毒：a组轮状病毒(rotavirusa)、诺如病毒(norovirus，nv)、札如病毒(sapovirus，sav)、腺病毒(andeovirus，adv)、星状病毒(astrovirusses，astv)引起。其中诺如病毒和札如病毒同属杯状病毒科，病毒分型较多，诺如病毒根据其vp1区基因可分为gi、gii、giv、gviii及gix型，其中引起人急性腹泻的主要为gi和gii型，据2014-2018年疫情监测数据显示诺如病毒感染病例中87.64％由gii型引起，6％由gi型引起，6.36％为gi和gii混合感染引起。札如病毒同样基于vp1区基因可分为gi～gxiv共14个型别，其中仅gi、gii、giv和gv感染人类，引起人急性腹泻，在我国gi和gii型检出率高于其他型别。

3、近年来病毒性腹泻越来越受各国疾控部门的重视，急需开展多病毒的检测为腹泻相关病毒的诊断、预防和控制提供理论依据，建立快速检测和筛査腹泻病原谱的方法。同时研究腹泻病原体的种类和流行病学，将有助于控制腹泻病原体在全球范围内的流行与传播。

4、常规腹泻病原体检测方法多为手工(或机器)提取病毒核酸，手工配制pcr反应体系，将核酸手工加入pcr反应体系后，在荧光定量pcr仪上进行实时荧光rt-pcr反应以定性检测病毒。在实际检测中，这种常规检测方法有一定的局限性。bd max全自动工作站方法是集标本核酸提取和实时荧光rt-pcr检测于一体的全自动分子生物学检测系统，可开放式兼容荧光检测试剂盒，只需一间实验室一台机器就能全自动完成核酸提取、扩增和结果分析，因此可在一定程度上解决常规检测方法中的问题。

5、对于常规用于bd max的多重pcr检测产品目前主要存在两个主要问题。第一，多种引物的存在使得引物对之间不可避免地存在相互干扰和竞争，尤其是引物二聚体的形成，导致引物不能有效地引导扩增。这里的引物二聚体不仅表现在引物对之间的两个引物，更多的是各引物对之间。而且随着重数的增加，引物对之间的干扰对pcr扩增效率的影响也会加大。第二，由于引物或目的片段本身的不同，如tm值，gc含量、长度、模板量等参数以及引物之间干扰的程度，导致各目的片段的扩增效率不均衡，即产物模板比例失调，甚至出现假阴性。

6、通常会使用通用引物解决上述多重pcr产生的问题，而现有通用引物均针对传统pcr设备设计，直接用于采用微孔阵列芯片进行pcr反应的bd max设备中可能发生芯片对pcr扩增的抑制；bd max设备与传统实时荧光pcr设备荧光信号读取方式不同；由于微型化芯片的热循环体积减小及结合集成的微型化热循环模块而提高的升降温速率等原因导致的信号值偏低、ct值推后等问题。

7、因此，本领域中存在对可以更高效地实现腹泻病毒多指标同检的引物及探针的需要。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，在第一个方面，本发明的目的在于提供1、一种用于腹泻病毒多指标同检的嵌合引物，其特征在于，所述嵌合引物中的上游引物的5’端至3’端依次为通用引物和基因特异性引物。

2、在具体的实施方案中，本发明的嵌合引物中所述通用引物的序列可以为seq idno.16。在优选的实施方案中，本发明的嵌合引物中所述通用引物的5’端第一位、第四位核苷酸及3’端第一位核苷酸可以是经过锁核酸修饰的。

3、在具体的实施方案中，本发明的嵌合引物中所述通用引物可以是单条tag引物。

4、在具体的实施方案中，本发明的嵌合引物可以用于轮状病毒a组、诺如病毒(ⅰ/ⅱ型)、星状病毒、札如病毒、肠道腺病毒(40/41型)的多指标同检。

5、在具体的实施方案中，本发明的嵌合引物中的所述基因特异性引物包括针对轮状病毒a组的一对上下游引物seq id no.1和seq id no.2；针对诺如病毒ⅰ型的两条上游引物seq id no.3、seq id no.4和一条下游引物seq id no.5；针对诺如病毒ⅱ型的两条上游引物seq id no.6、seq id no.7和一条下游引物seq id no.8；针对星状病毒一对上下游引物seq id no.9和seq id no.10；针对札如病毒的两条上游引物seq id no.11、seq id no.12和一条下游引物seq id no.13；和针对腺病毒40/41型的一对上下游引物seq id no.14和seq idno.15。

6、在本发明的第二个方面，本发明的目的在于提供一种用于腹泻病毒多指标同检的试剂盒，其特征在于，其中所述试剂盒包括如第一方面所述的嵌合引物和探针。

7、在具体的实施方案中，本发明的试剂盒中所述探针为taq-mgb探针。在优选的实施方案中，本发明的试剂盒中所述探针的5’端可以分别由激发波长464-490nm、发射波长510-530nm；激发波长520-540nm、发射波长559-571nm；激发波长555-598nm、发射波长618-638nm；激发波长622-636nm、发射波长657-670nm；激发波长673-683nm、发射波长710-790nm的五种荧光基团修饰。

8、在具体的实施方案中，本发明的试剂盒中所述探针可以包括针对轮状病毒a组的探针seq id no.17，针对诺如病毒ⅰ型的探针seq id no.18，针对诺如病毒ⅱ型的探针seqid no.19，针对星状病毒的探针seq id no.20，针对札如病毒的探针seq id no.21、seq idno.22，和针对腺病毒40/41型的探针seq idno.23。

9、在本发明的第三个方面，本发明的目的在于提供一种腹泻病毒多指标同检的实时荧光pcr检测方法，所述方法包括使用如第一个方面所述的嵌合引物或如第二个方面所述的试剂盒。

10、在具体的实施方案中，本发明的实时荧光pcr检测方法中扩增反应条件为逆转录阶段50℃5min；预变性阶段95℃2min；扩增阶段95℃15s、60℃55s，循环40次。

11、与现有技术相比，本发明的试剂盒具有以下优点：

12、(1)本发明的嵌合引物在保证反应特异性的同时，大大降低了多重pcr的偏向性，在bd max全自动工作站中可在一次实验运行中高效完成5个荧光通道生物检测；

13、(2)本发明的taq-mgb探针可在一个反应管内同时检测5种不同的病原体，使实验操作更加简便，缩短了检测时间，极大的提升了检测效率。

14、(3)本发明的嵌合引物多重荧光pcr方法可以同时扩增5种病原体(包含10个基因分型)，其操作简便、灵敏度高、特异性和稳定性好，可以用于我国常见腹泻病毒流行型别的快速检测和分型，为腹泻病毒的检测提供新的方法。同时对该方法进行评价，以实现腹泻病毒的快速检测，将为腹泻疾病的临床治疗和流行病学研究提供有效的参考，为病毒性腹泻暴发流行的应对提供技术储备。