一种黑水虻抗菌肽异源表达系统构建及其应用

本发明属于生物基因工程的，具体涉及一种黑水虻抗菌肽异源表达系统构建及其应用。

背景技术：

1、黑水虻(hermetiaillucens l.)是一种腐生性的水虻科昆虫，能够以养殖动物粪便、餐厨垃圾以及农业废弃物为食。黑水虻幼虫营养丰富，含粗蛋白质40％，脂肪30％以上，是一种新型的饲料资源。除此之外，黑水虻富含各类抗菌肽，如防御素、天蚕素、攻击素等等，这些抗菌肽对于革兰氏阴性和阳性病原菌有不同的抗菌功能，关注和开发黑水虻抗菌肽资源一直是饲料行业的重点研究内容。

2、但是传统的从黑水虻中直接获取抗菌肽的方法过于繁琐，需要经过诱导、提取和纯化等环节，而且由于抗菌肽在虫体体内含量较低，传统纯化的方法难以获得大量的抗菌肽，因而制备效率和成本均较高。使用大肠杆菌、酵母菌等异源表达方法将抗菌肽基因导入宿主中，是解决这一问题的一大策略，但是这些宿主可能会产生毒性物质，如内毒素，加大了后续抗菌肽纯化难度和成本，并影响作为动物饲料添加剂的使用安全性；此外一些诱导抗菌肽表达的诱导剂残留也是产生安全问题的隐患。因此开发一种低毒诱导剂、宿主安全性高的黑水虻抗菌肽异源表达方法对于开发和利用黑水虻抗菌肽资源至关重要。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供具有宿主安全、益生，诱导剂无毒、廉价的黑水虻抗菌肽异源表达方法，提供一种黑水虻抗菌肽异源表达系统构建及其应用。

2、本发明提出了如下技术方案：

3、本发明提供了一种黑水虻抗菌肽，所述黑水虻抗菌肽为将黑水虻防御素串联、与信号肽连接，经密码子优化获得；

4、所述黑水虻防御素的氨基酸序列如seq id no.1所示；

5、所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示；

6、所述串联为直接连接或者通过连接酶连接；

7、当连接酶为linker连接酶时，形成的黑水虻抗菌肽的核酸序列如seq id no.3所示，其氨基酸序列如seq id no.4所示。

8、本发明还提供了一种黑水虻抗菌肽异源表达系统的构建方法，包括如下步骤：

9、1)将黑水虻防御素串联、与信号肽连接，通过人工合成之后经密码子优化获得上述黑水虻抗菌肽，将其构建于表达载体上，获得重组质粒；

10、所述表达载体包括puc57、puc18和puc19的一种；

11、所述pcr扩增采用的引物对的核酸序列如seq id no.5和se q id no.6所示；

12、2)将乳酸菌表达载体进行pcr反向扩增，经酶切获得酶切产物b；

13、所述乳酸菌表达载体包括pnz8149、pnz2118和pnz2218的一种；

14、所述乳酸菌表达载体进行pcr反向扩增的引物对的核酸序列如seq id no.7和seqid no.8所示；

15、3)将pcr产物a和酶切产物b进行无缝克隆连接，获得乳酸菌表达质粒；

16、4)将乳酸菌表达质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，即构建得到黑水虻抗菌肽异源表达系统；

17、所述乳酸乳球菌感受态细胞包括nz3900和nz8149的一种。

18、本发明还提供了利用上述构建方法得到的黑水虻抗菌肽异源表达系统发酵获得黑水虻抗菌肽。

19、本发明的有益效果如下：

20、本发明的黑水虻抗菌肽异源表达系统，通过将黑水虻防御素串联、与信号肽连接、密码子优化获得重组黑水虻抗菌肽，将其构建重组质粒，双酶切后构建于乳酸菌获得乳酸菌表达系统，该系统具有宿主安全、表达抗菌肽稳定性高、产生抗菌肽的抗菌效果好的特点。

技术特征：

1.一种黑水虻抗菌肽，其特征在于，所述黑水虻抗菌肽为将黑水虻防御素串联、与信号肽连接，经密码子优化获得；

2.根据权利要求1所述的黑水虻抗菌肽，其特征在于，所述串联为直接连接或者通过连接酶连接。

3.根据权利要求1所述的黑水虻抗菌肽，其特征在于，所述黑水虻抗菌肽的核酸序列如seq id no.3所示，其氨基酸序列如seqid no.4所示。

4.一种黑水虻抗菌肽异源表达系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的黑水虻抗菌肽异源表达系统的构建方法，其特征在于，步骤1)所述表达载体包括puc57、puc18和puc19的一种。

6.根据权利要求4所述的黑水虻抗菌肽异源表达系统的构建方法，其特征在于，步骤1)所述pcr扩增采用的引物对的核酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示。

7.根据权利要求4所述的黑水虻抗菌肽异源表达系统的构建方法，其特征在于，步骤2)所述乳酸菌表达载体包括pnz8149、pnz2118和pnz2218的一种。

8.根据权利要求4所述的黑水虻抗菌肽异源表达系统的构建方法，其特征在于，步骤2)所述乳酸菌表达载体进行pcr反向扩增的引物对的核酸序列如seq id no.7和seq id no.8所示。

9.根据权利要求4所述的黑水虻抗菌肽异源表达系统的构建方法，其特征在于，步骤4)所述乳酸乳球菌感受态细胞包括nz3900和nz8149的一种。

10.利用权利要求4～9任一项所述构建方法得到的黑水虻抗菌肽异源表达系统发酵获得黑水虻抗菌肽。

技术总结
本发明属于生物基因工程的技术领域，具体涉及一种黑水虻抗菌肽异源表达系统构建及其应用，通过将黑水虻防御素串联、与信号肽连接、密码子优化获得重组黑水虻抗菌肽，将其构建重组质粒，双酶切后构建于乳酸菌获得乳酸菌表达系统，该系统具有宿主安全、表达抗菌肽稳定性高、产生抗菌肽抗菌效果好的特点。

技术研发人员：易宏波,苏玲玲,王丽,杨雪芬,温晓鹿,胡胜兰,肖昊,邱月琴
受保护的技术使用者：广东省农业科学院动物科学研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13