一种用于猫细小病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及病毒的分子生物学检测，尤其涉及一种用于猫细小病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用。

背景技术：

1、猫细小病毒病(feline panleukopenia，fp)又称猫泛白细胞减少症、猫瘟、猫传染性肠炎，是由猫细小病毒(feline panleukopenia virus，fpv)引起的一种急性高度接触性传染病，1岁龄以下的猫最容易感染，尤其是3～6月龄的幼猫，病猫主要表现为机体内白细胞数量急剧减少，fpv还对猫科动物的消化道系统造成巨大伤害，病猫表现出严重的消化道症状。目前fpv的病例量占猫传染病病例量的60％以上，是名副其实的猫科动物的头号杀手，因此建立一种快速、准确、特异和灵敏的检测方法势至关重要。

2、fpv的检测方法有快速试纸板检测法、血凝和血凝抑制(ha-hi)试验、电镜观察、免疫荧光试纸检测、实时荧光pcr检测等，但基于操作的方便性及营收状况，主要的临床确诊方法有胶体金试纸板检测、免疫荧光试纸检测、实时荧光pcr检测等方法。

3、目前还没有关于猫细小病毒lamp检测的报道。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于猫细小病毒lamp检测的引物组、试剂盒及应用，本发明的引物组具有检测灵敏度高和特异性强的优势。

2、本发明提供了一种用于猫细小病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物fpv-1-f3、fpv-1-b3，内引物fpv-1-fip、fpv-1-bip和环引物fpv-1-lf、fpv-1-lb；所述fpv-1-f3的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述fpv-1-b3的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述fpv-1-fip的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述fpv-1-bip的核苷酸序列如seq idno：4所示；所述fpv-1-lf的核苷酸序列如seq id no：5所示；所述fpv-1-lb的核苷酸序列如seq id no：6所示。

3、本发明提供了一种用于猫细小病毒lamp检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。

4、优选的，所述试剂盒还包括bst2.0 warmstart dna聚合酶、缓冲液和酸碱指示剂。。

5、优选的，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

6、优选的，所述阳性对照品为包括猫细小无感染性基因片段；所述阴性对照品为双蒸水。

7、本发明还提供了上述方案所述的引物组或所述的试剂盒在非诊断目的的猫细小病毒lamp检测中的应用，所述应用包括以下步骤：

8、1)将待测样品进行裂解后，得到裂解后的样品液；

9、2)以所述裂解后的样品液为模板，利用权利要求1所述引物组中的外引物fpv-1-f3、fpv-1-b3、内引物fpv-1-fip、fpv-1-bip和环引物fpv-1-lf、fpv-1-lb，进行lamp扩增反应，获得lamp扩增产物；

10、3)根据步骤2)中所述扩增产物的颜色判断待测样品是否含有猫细小病毒当显色为黄色或橙色时，则待测样品中含有猫细小病毒，当显色为紫红色或粉红色时，则待测样品中不含猫细小病毒。

11、优选的，步骤1)中所述裂解时，所用溶液为样品裂解液；所述待测样品和样品裂解液的体积比为2:5；所述裂解的条件为95℃5min。

12、优选的，步骤2)中所述lamp扩增反应使用的反应体系以10μl计包括：0.67μlbst2.0 warmstart dna聚合酶、8.33μl缓冲液和0.67μl酸碱指示剂；

13、所述引物组由以下终浓度的成分组成：10μm的fpv-1-f3 0.5μl、10μm的fpv-1-b30.5μl、20μm的fpv-1-fip 2μl、20μm的fpv-1-bip 2μl、20μm的fpv-1-lf 1μl、20μm的fpv-1-lb 1μl和ddh2o 1μl。

14、优选的，所述lamp扩增反应的程序为：65℃50min，15℃2min。

15、本发明提供了一种用于猫细小病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物fpv-1-f3、fpv-1-b3，内引物fpv-1-fip、fpv-1-bip和环引物fpv-1-lf、fpv-1-lb。本发明引物组在恒温65℃条件下，能够实现猫细小病毒(fpv)的检测，与普通pcr相比，在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。包含本发明的引物组的试剂盒具有操作简便、敏感性高、重复性好和特异性强的特点。

技术特征：

1.一种用于猫细小病毒lamp检测的引物组，所述引物组包括外引物fpv-1-f3、fpv-1-b3，内引物fpv-1-fip、fpv-1-bip和环引物fpv-1-lf、fpv-1-lb：

2.一种用于猫细小病毒lamp检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物组。

3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应预混液，所述反应预混液包括bst2.0warmstartdna聚合酶、缓冲液和酸碱指示剂。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为包括猫细小无感染性基因片段；所述阴性对照品为双蒸水。

6.权利要求1所述的引物组或权利要求2～5任意一项所述的试剂盒在非诊断目的的猫细小病毒lamp检测中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述lamp扩增反应使用的反应体系以20μl计包括：反应预混液10μl、引物组8μl和裂解后的样品液2μl；

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述lamp扩增反应的程序为：65℃50min，15℃2min。

9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤1)中所述裂解时，所用溶液为样品裂解液；所述待测样品和样品裂解液的体积比为2:5；

技术总结
本发明属于病毒的分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种用于猫细小病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及应用；所述引物组包括外引物FPV‑1‑F3、FPV‑1‑B3，内引物FPV‑1‑FIP、FPV‑1‑BIP和环引物FPV‑1‑LF、FPV‑1‑LB。本发明引物组在恒温65℃条件下，能够实现猫细小病毒(FPV)的检测，与普通PCR相比，在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短，适用于现场快速检测。包含本发明的引物组的试剂盒具有操作简便、敏感性高、重复性好和特异性强的特点。

技术研发人员：武小琰,潜奕青,刘佳铤,余飞
受保护的技术使用者：杭州百裕生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13