低背景的P16-INK4a染色试剂盒及其应用方法
【专利摘要】本发明提供一种低背景的P16-INK4a染色试剂盒及其应用方法，该试剂盒包括：试剂A、试剂B、试剂C、试剂D；其中，所述试剂A包括：P16-INK4a单克隆抗体、背景去除剂、稀释度1:1000-1:6000为0.05MPBS；所述试剂B包括：生物素标记的二抗、背景去除剂；所述试剂C包括:辣根过氧化物酶标记的长臂链霉亲和素复合物；所述试剂D包括:DAB显示液。本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、低背景的特点；检测方法操作方便、简单，便于医院使用和推广。
【专利说明】低背景的P16-1 NK4a染色试剂盒及其应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞学涂片染色【技术领域】，尤其涉及一种低背景的P16_INK4a染色试 剂盒及其应用方法。
【背景技术】
[0002] P16_INK4a是第一个确定的直接参与细胞周期调控的抑癌基因，定位于人类染色 体9p21，全长8. 5kb，编码一种分子量为16000的蛋白质，故又称pl6基因，pl6蛋白为 cyclinD-CDK4复合物的抑制蛋白，故又称P16-INK4a。P16-INK4a蛋白通过抑制视网膜母 细胞瘤蛋白（pRb)的磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞增殖。在此调节级 联中，pRb对P16-INK4a蛋白表达进行负反馈抑制，但在HR-HPV感染的宫颈癌组织中，由 于HR-HPV E7蛋白结合pRb，使其功能失活，解除了 pRb对P16-INK4a蛋白表达的负反馈 抑制，引起P16_INK4a过表达，P16-INK4a蛋白可作为一种生物学标记物进行宫颈癌的早期 筛查。
[0003] 宫颈癌（cervical cancer,CC)是全球妇女恶性肿瘤中第二大常见恶性肿瘤，宫 颈癌病因学研究确立了人乳头瘤病毒（HPV)感染是宫颈癌发生的主要因素。在正常宫颈 上皮一宫颈上皮内瘤变一宫颈癌这一进展过程中，HPV导致某些基因结构、功能发生变化， 其中，P16-INK4a基因作为抑癌基因直接作用于细胞周期，控制细胞生长与分化，参与肿瘤 形成与发展。研究显示，P16_INK4a几乎在100% HRHPV感染导致的宫颈癌和癌前病变中过 表达，而在HPV阴性的宫颈癌和正常组织中无表达，其作为一种生物学标记物可用于宫颈 癌的早期筛查。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种低背景的P16-INK4a染色试剂盒及其应用方法，以简 单，快速，准确对宫颈液基细胞学涂片染色。
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供的低背景的P16-INK4a染色试剂盒包括：试剂A、 试剂B、试剂C、试剂D ;其中，所述试剂A包括：P16-INK4a单克隆抗体、背景去除剂、稀释度 1:1000-1:6000为0. 05M PBS (磷酸盐缓冲液）；所述试剂B包括：生物素标记的二抗、背景 去除剂；所述试剂C包括：辣根过氧化物酶标记的长臂链霉亲和素复合物；所述试剂D包 括：DAB (二氨基联苯胺，Diaminobenzidine，简称DAB)显不液。
[0006] 优选地，所述背景去除剂为多种短链蛋白质混合物。
[0007] 优选地，所述背景去除剂包括牛血清白蛋白，兔肌动蛋白。
[0008] 优选地，所述DAB显示液为1滴DAB原液混合1ml DAB缓冲液；其中，所述DAB缓 冲液包括：咪唑3. 4g、蒸馏水1000ml、H202 (浓度30%) 2ml、6N盐酸调至PH=7. 4 ;所述DAB 原液为125mM DAB配制，包括DAB1. 5g、丙二醇19. 5ml、6N盐酸0. lml。
[0009] 为了实现上述目的，本发明提供一种上述低背景的P16-INK4a染色试剂盒的应用 方法，其包括以下步骤：宫颈细胞涂片至水，抗原修复；3%H202室温孵育5-10分钟，以消 除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡5秒钟；滴加试剂A，30min ; PBS冲洗， 5秒钟；滴加试剂B，10分钟；PBS冲洗，5秒钟；滴加试剂C，10分钟；PBS冲洗，5秒钟；滴 加试剂D，显色3-5分钟；自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
[0010] 本发明提供一种试剂盒及其在检测宫颈癌和宫颈上皮内瘤变细胞中的应用方法， 其中，试剂盒具有灵敏度高、低背景的特点；检测方法操作方便、简单，便于医院使用和推 广。
【具体实施方式】
[0011] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步详细说明。
[0012] 本发明提供的染色试剂盒包括四种试剂，分别为试剂A、试剂B、试剂C、试剂D，四 者可以用或塑料瓶、或玻璃瓶等承装。
[0013] 其中，试剂A包括P16-INK4a单克隆抗体、背景去除剂、稀释度为1:1000-1:6000 的（λ 05M PBS。
[0014] 试剂B包括生物素标记的二抗、背景去除剂。
[0015] 试剂C包括辣根过氧化物酶标记的长臂链霉亲和素复合物。
[0016] 试剂D包括DAB显示液，其按照1滴DAB原液混合1ml DAB缓冲液配制。优选地， DAB缓冲液包括咪唑3.4g、蒸馏水 1000ml、H202 (浓度30%)2ml、6N盐酸调至PH=7.4。DAB 原液由125mM DAB配制，具体而言，按照DAB1.5g、丙二醇19. 5ml、6N盐酸0. lml的配制。
[0017] 优选地，背景去除剂为多种短链蛋白质混合物，更优选地你，含牛血清白蛋白，兔 肌动蛋白等。
[0018] 在应用上述P16_INK4a染色试剂盒时，可以应用以下操作步骤： 宫颈细胞涂片至水，抗原修复。
[0019] 3%H202室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
[0020] 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5秒钟。
[0021] 滴加试剂A工作液30min。
[0022] PBS冲洗，5秒钟。
[0023] 滴加适量试剂B工作液10分钟。
[0024] PBS冲洗，5秒钟 滴加适量的试剂C工作液，10分钟。
[0025] PBS冲洗，5秒钟。
[0026] 滴加试剂D液，显色3-5分钟。
[0027] 自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
[0028] 另外，介绍常规免疫组化操作步骤如下： 宫颈细胞涂片至水，抗原修复。
[0029] 3%H202室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
[0030] 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟x2。
[0031] 5-10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗。滴加一 抗工作液，37°C孵育1-2小时或4°C过夜。
[0032] PBS冲洗，5分钟x3次。
[0033] 滴加适量生物素标记二抗工作液，37°C孵育10-30分钟。
[0034] PBS冲洗，5分钟x3次。
[0035] 滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37°C孵育10-30分 钟。
[0036] PBS冲洗，5分钟x3次。
[0037] 滴加显色剂DAB显色3-15分钟。
[0038] 自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
[0039] 综上，在宫颈液基细胞学涂片染色时，不加 P16_INK4a (-抗)，常规免疫组化可 以显示部分阳性，而本发明的P16-INK4a染色试剂盒全阴性，表明常规免疫组化染色在宫 颈液基细胞学染色时存在非特异性染色，而P16_INK4a试剂盒不存在非特异性染色。由上 可知，本发明提供的P16_INK4a染色试剂盒是一种适合在宫颈液基细胞学涂片染色的试剂 盒，P16-INK4a试剂盒不存在非特异性染色，冲洗时间缩短，染色时间减短，操作简单，快速， 准确。
[0040] 由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方 案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所 有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。
【权利要求】
1. 一种低背景的P16-INK4a染色试剂盒，其特征在于，包括：试剂A、试剂B、试剂C、试 剂D ; 其中，所述试剂A包括：P16-INK4a单克隆抗体、背景去除剂、稀释度1:1000-1:6000为 0. 05M PBS ； 所述试剂B包括：生物素标记的二抗、背景去除剂； 所述试剂C包括：辣根过氧化物酶标记的长臂链霉亲和素复合物； 所述试剂D包括：DAB显示液。
2. 根据权利要求1所述的低背景的P16-INK4a染色试剂盒，其特征在于，所述背景去除 剂为多种短链蛋白质混合物。
3. 根据权利要求2所述的低背景的P16-INK4a染色试剂盒，其特征在于，所述背景去除 剂包括牛血清白蛋白，兔肌动蛋白。
4. 根据权利要求1所述的低背景的P16-INK4a染色试剂盒，其特征在于，所述DAB显示 液为1滴DAB原液混合lml DAB缓冲液； 其中，所述DAB缓冲液包括：咪唑3.4g、蒸馏水 1000ml、H202 (浓度30%)2ml、6N盐酸 调至 ΡΗ=7· 4 ; 所述DAB原液为125mM DAB配制，包括DAB1. 5g、丙二醇19. 5ml、6N盐酸0. lml。
5. -种权利要求1-4任一所述低背景的P16_INK4a染色试剂盒的应用方法，包括以下 步骤：宫颈细胞涂片至水，抗原修复； 3%H202室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性； 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5秒钟； 滴加试剂A，30min ; PBS冲洗，5秒钟； 滴加试剂B，10分钟； PBS冲洗，5秒钟； 滴加试剂C，10分钟； PBS冲洗，5秒钟； 滴加试剂D，显色3-5分钟； 自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
【文档编号】G01N1/30GK104155167SQ201310200618
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月27日 优先权日:2013年5月27日
【发明者】徐显辉 申请人:厦门菲尔科生物技术有限公司