一种用于miRNA检测的dT引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及生物检测，特别是涉及一种用于mirna检测的dt引物、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、micro rna(mirna)是一类长约22个核苷酸的非编码单链小分子rna，广泛参与了生命活动各个层次的调节，包括胚胎发育、器官形成、细胞增殖、细胞凋亡、细胞应激应答、干细胞分化，内分泌调控、免疫调节和疾病的发生与发展。其通过与靶mrna3’非编码区(3’utr)的特异性结合，降解靶mrna或阻遏其转录后翻译，最终导致靶基因的蛋白质合成减少。大量的研究结果表明，恶性肿瘤等重大疾病的发生和发展与人体内mirnas的异常表达有密切关系，这就意味着mirnas将有巨大的潜力成为新的生物标志物，可用于癌症等重大疾病的早期诊断，可作为新的基因药物作用靶点。

2、mirna检测方法大致分为探针杂交法和实时定量pcr(quantitative real-timepcr)法两类。基于探针杂交法主要有northern blot技术、生物芯片技术、基于微球的流式细胞术。这些技术的原理是将探针与rna样品进行杂交，然后进行信号检测。northern blot技术作为检测rna的经典方法，常用来评价其它方法的可靠性；但这种技术对样品要求量大，操作相对费时费力，不适合高通量分析。生物芯片技术能实现mirna的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个mirna；但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵。基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获mirna序列，提高了准确性；但该技术须使用特殊的流式细胞仪和微球，实验成本高，同样不利于推广。

3、相比探针杂交法，实时定量pcr(quantitative real-time pcr)技术检测mirna的表达是当前mirna研究中最为常用的技术手段之一。基于real-time rt-pcr的mirna检测方法主要包括茎环引物(stem loop)法和poly(a)聚合酶加尾法两种。

4、茎环引物法使用3’端有6个碱基与mirna互补配对的引物来进行mirna的反转录，同时反转录引物的5’端含有一个茎环结构，能增强mirna和dna异质双链的亲合力，特异性高，通过特异性正、反向引物、探针实现mirna的qpcr检测。但由于特异性探针的使用使得颈环法的成本大大提高，对于高通量的mirnas分析来说过于昂贵。

5、poly(a)聚合酶加尾法是先用poly(a)聚合酶使mirna的3’端带上一段poly(a)尾巴，然后用5’端含有接头序列的oligo(dt)引物进行反转录，完成cdna合成。利用一条mirna序列特异的正向引物即可实现pcr扩增。该方法的优点是简便、快速，反转录引物对mirna具有通用性，因此检测成本较低；但由于poly(a)聚合酶对rna无差别添加ploy(a)尾巴，逆转录引物也无特异性，直接导致加尾法检测结果可能为pre-mirna和成熟mirna的总和，降低了检测的特异性和灵敏性。

6、cn102154505a公开了一种检测mirna的方法及其应用，使用由特异碱基和oligo(dt)组成的反转录引物对样品中mirna进行反转录，然后用特异上游引物、通用下游引物和通用探针对mirna进行real-time pcr定量检测。此方法虽可特异性检测mirna分子，但和茎环引物法一样，不能实现一次反转录获得全部mirnas分子的cdna产物。每种mirna分子检测都需要单独设计特异性的反转录引物，且特异性探针的使用使得成本较高。

技术实现思路

1、鉴于上述问题，本发明提供了一种用于mirna检测的dt引物、试剂盒及检测方法。通过提升线性通用反转录引物及检测引物的特异性，同时兼具降低成本及实用性，以检测、定量和分析mirna的表现量。

2、为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种用于mirna检测的dt引物，其在5’至3’方向上由4个片段组成，分别为：反转录起始序列、通用短链引物universal pcrprimer r序列、28个oligo(dt)序列和识别mirna的3’端2个简并碱基序列。

3、在本发明中，2个碱并碱基设计可有效识别所有的micro rna分子的3’端起始序列，能有效控制反转录合成的cdna长度，以及cdna纯度。纯度较高的cdna模板能增加检测结果的准确性和特异性。

4、优选地，所述dt引物的核苷酸序列如seq id no：1所示。

5、优选地，所述反转录特异性的长链dt引物长度为50-60个碱基；所述通用短链检测引物universal pcr primer r的长度为20个碱基，tm值为55-65℃之间。

6、在本发明的第二方面，提供了一种用于mirna检测的试剂盒，包含上所述的dt引物。

7、优选地，还包括mirna反转录反应混合液，cdna扩增反应混合液。

8、优选地，所述mirna反转录反应混合液包括2*mirnabuffer，e.coli poly(a)polymerase酶，reverse transcriptase酶，dntp mix。

9、优选地，所述cdna扩增反应混合液包括2*mirnaqpcr buffer，udg酶，taq酶，dntps，sybr green染料，通用短链引物universal pcr primer r，特异性短链检测引物forward u6primer f。

10、在本发明中，特异性短链引物forward primer是待测mirna的5’端起始的16-20个碱基相同的序列和特定的4个碱基。通用短链引物universal pcr primer r与特异性长链引物序列的一部分序列相同。

11、优选地，所述通用短链引物universal pcr primer r的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述特异性短链检测引物forward u6 primer f的长度为18-25个碱基，tm值为55-65℃之间，核苷酸序列如seq id no：3所示。

12、更为优选地，所述cdna扩增反应混合液的配比如下：2*mirna qpcr buffer 10ul；udg酶0.1u-1u；taq酶1-5u；dntps 0.20-0.40mm；forward u6 primer f 1-2um；universalpcr primer r1-2um；sybr green 1-4ul；rnase-free water至20ul。

13、在本发明的第三方面，还提供了一种mirna的检测方法，，采用上述试剂盒对样品mirna进行荧光实时定量pcr检测，根据荧光信号判断样品mirna分子表现量。

14、优选地，所述pcr扩增程序为：

15、udg酶反应50℃，3-5min；

16、预变性95℃，1-3min；

17、变性95℃，5-20s；

18、退火、延伸55-65℃，20-35s；40个循环；

19、荧光采集95℃/15s，95℃/60s，95℃/15s。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、1.本发明提供的反转录dt引物由4个片段组成，分别为反转录起始序列，通用检测引物universal pcr primer r序列、28个oligo(dt)序列、以及识别mirna的3’端2个碱基序列。可有效控制cdna片段合成的长度以及提高引物的特异性，从而提升检测灵敏度。

22、2.本发明提供的试剂盒和检测方法可对成熟的mirna同时完成poly(a)加尾反应和反转录cdna合成反应，1h内即可获得高浓度的、包含所有mirnas分子的cdna产物，可用于多个mirna分子的检测。获得的cdna产物可直接使用本试剂盒的mirna荧光定量pcr试剂盒进行定量检测。

23、3.本发明提供的mirna荧光定量pcr试剂盒加入了udg酶防污染体系，可有效减少污染对实验结果影响。