一种可妥度肽的固相合成方法与流程

本发明属于多肽药物固相合成，具体涉及一种可妥度肽的固相合成方法。

背景技术：

1、gcgr和glp-1r是g蛋白偶联受体家族成员，它们是维持人体血糖平衡的两个重要调节器：在饥饿状态下，gcgr通过与其配体胰高血糖素结合来提高人体血糖水平；而glp-1r主要在摄食后发挥作用，通过与其配体胰高血糖素样肽-1结合，刺激胰岛素分泌，使餐后血糖降低并维持在正常水平。目前，开发靶向gcgr/glp-1r的双重激动剂，已成为治疗糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝炎（nash）等疾病的一个新方向。

2、cotadutide是一款gcgr和glp-1r双重激动剂，它具有多种作用方式，不但可以通过激活glp-1受体，提高胰岛素分泌并且降低食物摄入，而且可以通过激活胰高血糖素受体起到降低炎症和脂肪生成等效果。目前，该产品正在被开发用于2型糖尿病、肥胖、nash、糖尿病肾病等治疗领域，已在一项针对2型糖尿病患者的随机、双盲、2a期研究中，初步证实了其降糖作用是由增强的胰岛素分泌和延迟的胃排空介导。更多临床研究结果显示，在患有脂肪肝的2型糖尿病超重患者中，cotadutide表现出降低肝脏脂肪水平和减轻肝纤维化的效果，cotadutide的中文名称为可妥度肽，cas号为1686108-82-6，分子量为3728.09，cotadutide具有以下的结构：

3、h-his1-ser2-gln3-gly4-thr5-phe6-thr7-ser8-asp9-lys10(γ-glu-pal)-ser11-glu12-tyr13-leu14-asp15-ser16-glu17-arg18-ala19-arg20-asp21-phe22-val23-ala24-trp25-leu26-glu27-ala28-gly29-gly30-oh。

4、cotadutide的制备方法尚已有报道，根据合成经验，在生产过程中一般都是逐个偶联cotadutide的主链和侧链，由于cotadutide的序列较长且有较多的疏水氨基酸，采用氨基酸逐步缩合的方法合成时，易形成折叠，导致树脂收缩严重，延长反应时间，进而粗肽中产生较多与产品性质极为接近的杂质，如d-his的消旋杂质：

5、h-d-his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-lys(γ-glu-otbu-pal)-ser-glu-tyr-leu-asp-ser-glu-arg-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-glu-ala-gly-gly-oh；

6、+gly杂质：

7、h-his-ser-gln-gly-gly-thr-phe-thr-ser-asp-lys(γ-glu-otbu-pal)-ser-glu-tyr-leu-asp-ser-glu-arg-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-glu-ala-gly-gly-oh；

8、d-thr的消旋杂质：

9、h-his-ser-gln-gly-d-thr-phe-thr-ser-asp-lys(γ-glu-otbu-pal)-ser-glu-tyr-leu-asp-ser-glu-arg-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-glu-ala-gly-gly-oh；

10、d-phe的消旋杂质：

11、h-his-ser-gln-gly-thr-d-phe-thr-ser-asp-lys(γ-glu-otbu-pal)-ser-glu-tyr-leu-asp-ser-glu-arg-ala-arg-asp-phe-val-ala-trp-leu-glu-ala-gly-gly-oh。

12、这些消旋杂质会增加cotadutide的纯化难度，导致产品收率降低，本发明提供一种高效的cotadutide制备方法来生产高纯的产品，增加cotadutide的收率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种可妥度肽的固相合成方法，该方法制得的cotadutide具有较高的纯度。

2、本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

3、一种可妥度肽的固相合成方法，包括：

4、步骤1：固相载体树脂、fmoc-gly-oh经偶联剂偶联，再经缩合剂缩合，得到fmoc-gly-树脂；

5、步骤2：按照cotadutide肽序，依次偶联氨基酸或片段，其中lys10侧链采用fmoc-lys(γ-glu-otbu-pal)-oh片段，thr5-phe6采用fmoc-thr(tbu)-phe-oh片段，his1-ser2-gln3-gly4采用boc-his(trt)-ser(tbu)-gln(trt)-gly-oh片段，得到cotadutide肽树脂；

6、步骤3：经裂解液裂解得到cotadutide（可妥度肽）粗品。

7、本发明提供的一种cotadutide固相合成方法中，除了使用其他常规的保护氨基酸，同时还使用了以下特殊保护氨基酸或片段：boc-his(trt)-ser(tbu)-gln(trt)-gly-oh、fmoc-lys(γ-glu-otbu-pal)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh，降低了d-his消旋杂质、+gly杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了cotadutide的纯度和收率，降低了生产成本。

8、优选地，上述氨基酸或片段的总用量为所投树脂总摩尔数的2-3倍。

9、本发明制备cotadutide的具体固相合成方法为：取fmoc-gly-树脂，通过固相合成法，按cotadutide肽链从c端至n端肽序，依次偶联fmoc-gly-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-val-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-lys(γ-glu-otbu-pal)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-phe-oh、boc-his(trt)-ser(tbu)-gln(trt)-gly-oh得到cotadutide肽树脂，cotadutide肽树脂再经裂解得到cotadutide粗品。

10、具体地，上述cotadutide的固相合成方法，包括以下步骤：

11、步骤1：在固相载体树脂中加入dmf（两者的质量体积比为1g:7-8ml）进行溶胀，溶胀时间25-35min，真空过滤dmf，再用dmf洗涤树脂2-4次，然后加入fmoc-gly-oh、hobt（固相载体树脂与fmoc-gly-oh的质量比为1:0.45-0.55；固相载体树脂与hobt的质量比为1:0.25-0.35），再加入dmf（hobt与dmf的质量体积比为1g:9-12ml），鼓氮气将其溶解，然后在反应器中加入dic（hobt与dic的质量体积比为1g:1-1.3ml），5-8min后，加入缩合剂（缩合剂与dic的质量体积比为1g:10-15ml），反应2.5-3.5h，反应结束后，用dmf洗涤树脂2-4次，加入醋酸酐封端液（固相载体树脂与醋酸酐封端液的质量体积比为1g:18-23ml）封端1.5-2h，换液一次，继续封端1.5-2h，然后用dmf洗涤树脂4-6次，再用甲醇洗涤树脂2-4次，dcm洗涤树脂2-4次，mtbe洗涤树脂2-4次，然后将树脂干燥，直至恒重（1h内连续两次减重小于5%），得到fmoc-gly-树脂；

12、步骤2：在fmoc-gly-树脂中加入dmf（两者的质量体积比为1g:18-23ml）进行溶胀25-35min，然后抽去dmf，再用dmf洗涤树脂2-3次，然后加入pip/dmf溶液（其中，pip与dmf的体积比为1:3.5-4；fmoc-gly-树脂与pip/dmf溶液的质量体积比为1g:18-23ml）去保护25-35min，用dmf洗涤树脂4-6次，用茚三酮检测液检测，至树脂深蓝；然后称取fmoc-gly-oh、hobt（fmoc-gly-树脂与fmoc-gly-oh的质量比为1:0.35-0.45；fmoc-gly-树脂与hobt的质量比为1:0.15-0.25），加入dmf（fmoc-gly-树脂与dmf的质量体积比为1g:2.5-3.5ml）将其溶解，在冰水中预冷4-7min，然后加入dic（fmoc-gly-树脂与dic的质量体积比为1g:0.15-0.25ml）预活化，15-20min后将活化液加入到上述fmoc-gly-树脂去保护后的反应器中，鼓氮气反应，在27-35℃反应1-1.5h，用茚三酮检测液检测，溶液亮黄，树脂透明，然后抽去反应液，用dmf洗涤树脂4-7次，即得到fmoc-gly-gly-树脂；使用同样的操作流程，继续偶联剩余氨基酸或片段；偶联完成后，用甲醇洗涤2-3次，dcm洗涤2-3次，mtbe洗涤2-3次，然后干燥，直至恒重（1h内连续两次减重小于5%），得到cotadutide肽树脂；

13、步骤3：将肽树脂加入到裂解液（两者质量体积比为1g:6-10ml）中，室温条件下震荡反应1-3h，反应混合物用砂芯漏斗过滤，用tfa洗涤树脂2-3次，抽滤，合并收集滤液，在（-8）-（-12）℃，缓慢加入到mtbe中，边加边搅拌，白色固体析出后离心，弃去上层清液，固体沉降物使用mtbe洗涤3-5次，干燥至恒重（1h内连续两次减重小于5%），得到cotadutide粗品。

14、优选地，上述醋酸酐封端液包含：醋酸酐、diea、dmf；上述醋酸酐、diea与dmf的体积比为1:0.5-0.7:3.2-3.6。

15、优选地，上述固相载体树脂包含wang树脂（wang resin）。

16、优选地，上述固相载体树脂的取代度为0.3-1.0mmol/g，更优选地，上述固相载体树脂的取代度为0.55-0.6mmol/g。

17、优选地，上述偶联剂包含dic、hobt。

18、优选地，上述fmoc-gly-树脂的取代度为0.3-0.6mmol/g。

19、优选地，上述裂解液包含tfa、edt、tis、h2o；tfa、edt、tis、h2o的体积比为90:4.5-5.5:2-3:2-3。

20、优选地，上述缩合剂包含dmap、负载化dmap中的至少一种。

21、本发明还公开了一种负载化dmap的制备方法，包括：以柚皮甙为改性剂，联合硅烷偶联、环氧-醇加成，再经map与多氯基硅胶的n-烷基化反应，制得负载化dmap。

22、本发明公开了一种负载化dmap的制备方法，以γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷对硅胶进行表面修饰，得到带环氧基的硅胶；再通过柚皮甙对环氧基末端进行枝化得到多羟基硅胶；然后采用环氧氯丙烷与多羟基硅胶反应得到多氯基硅胶，再以碘化钾促进map与多氯基硅胶的n-烷基化反应将dmap负载到硅胶表面得到缩合催化剂。由于小分子均相dmap缩合催化剂在有机反应时，很难回收利用，可能会在产品中残留影响产品的品质，所以本发明合成一种负载化dmap具有活性高且易分离回收的特点，可进一步提升cotadutide的纯度；另外相较于烷烃的易缠结，可能由于柚皮甙中苯环等环状结构的存在使得dmap在硅胶表面分散的更加均匀，因此使得负载化dmap的活性进一步提升，能够更有效地促进氨基酸片段缩合，提高反应效率。

23、具体地，上述负载化dmap的制备方法，包括以下步骤：

24、在硅胶中加入甲苯（两者质量体积比为1g:10-15ml），室温搅拌混合25-35min，然后加入γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷（硅胶与γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的质量体积比为1g:0.8-1.3ml），在93-98℃回流反应15-20h，依次用甲苯和丙酮洗涤沉淀3-5次，干燥，制得环氧化硅胶，将环氧化硅胶加入到dmf（环氧化硅胶与dmf的质量体积比为1g:15-25ml）中，室温搅拌混合25-35min，加入柚皮甙（环氧化硅胶与柚皮甙的摩尔比为1:1.8-2.3），在45-55℃反应7-9h，搅拌速率500-550rpm，在反应过程中每隔2h加一次三氟化硼乙醚（环氧化硅胶与单次添加的三氟化硼乙醚的质量体积比为1g:0.2-0.25ml），离心，先后用dmf、去离子水、丙酮分别洗涤3-5次，干燥，制得多羟基硅胶；将多羟基硅胶加入到dmf（环氧化硅胶与dmf的质量体积比为1g:15-25ml）中，室温搅拌混合25-35min，加入环氧氯丙烷（多羟基硅胶与环氧氯丙烷的摩尔比为1:7-9），在45-55℃反应7-9h，搅拌速率500-550rpm，在反应过程中每隔1.5-2h加一次三氟化硼乙醚（环氧化硅胶与单次添加的三氟化硼乙醚的质量体积比为1g:0.2-0.25ml），离心，用dmf、去离子水依次洗涤3-5次，再用丙酮洗涤沉淀，干燥，制得多氯基硅胶；将多氯基硅胶加入到浓度为0.1mol/l的map的邻二甲苯溶液（多氯基硅胶与map的摩尔比为1:7-9）中，搅拌溶解后，加入ki、k2co3（其中，map与ki的摩尔比为1:0.8-1.2，map与k2co3的摩尔比为1:0.8-1.2），氮气氛围下，在120-130℃反应18-23h，过滤，无水乙醇、去离子水依次洗涤3-5次，干燥，制得负载化dmap。

25、本发明还公开了上述制备方法得到的负载化dmap在cotadutide固相合成中的用途。

26、本发明的有益效果包括：

27、本发明获得了一种可妥度肽的固相合成方法，本发明采用片段和逐步合成相结合的固相合成法，优化了工艺路线，简化了工艺流程，为工业大生产提供了保障；其中将his1-ser2-gln3-gly4采用boc-his(trt)-ser(tbu)-gln(trt)-gly-oh的片段连接，降低了d-his消旋杂质、+gly杂质的产生，显著降低了粗品纯化的难度，大大提高了cotadutide的纯度和收率，降低了生产成本。本发明还在制备过程中采用负载化dmap作为缩合剂，进一步提升了cotadutide的纯度。

28、因此，本发明提供了一种可妥度肽的固相合成方法，该方法制得的cotadutide具有较高的纯度。