一种重组L-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用

本发明涉及一种餐饮业废水处理装置，具体涉及一种重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、α-酮酸是一种重要的精细化工中间体，在医药、食品添加剂、食品、化妆品等化学合成领域有着广泛的应用。现阶段市场上大部分的酮酸都是通过化学合成的方法制备的，这样生产不仅不环保，而且还会产生各种有毒的副产品。随着生物工程技术的发展，酮酸的生物合成已被发现，并在微生物中应用不同的代谢工程策略以可再生碳水化合物生产特定的酮酸。

2、α-酮戊二胺酸(α-ketoglutaramic acid)，又叫做α-酮谷氨酸(α-ketoglutaramate)，2-氧戊二胺酸(2-oxoglutaramate)，2-羟基-5-氧脯氨酸(2-hydroxy-5-oxoproline)，在植物体内通过转氨酶和水解酶的连续作用下进行合成和代谢；在动物肝脏和肾脏中也发现了类似的转氨酶、水解酶以及α-酮戊二胺酸。α-酮戊二胺酸作为植物生长调节剂在农业上具有广泛的用途；在生物学研究中，人类ω-酰胺酶(腈水解酶，nitrilase 2)已被确定为一种公认的肿瘤抑制蛋白，可将癌细胞抑制在g2细胞周期阶段，nitrilase 2信息在研究过的每一个人体组织(心脏、大脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰腺、脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和白细胞)中都有表达，在肝脏和肾脏中表达最高，而α-酮戊二胺酸作为nitrilase2的底物，是研究该酶的规范作用和该酶在多种疾病中的作用所必需的。目前生产α-酮戊二胺酸最容易利用的制备方法是以蛇毒衍生的l-氨基酸氧化酶氧化l-谷氨酰胺，这不仅成本昂贵，而且在生产过程中会产生有害的h2o2。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌及其构建方法和应用，其可以解决上述背景技术提出的技术问题。

2、在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌。根据本发明的实施例，以来源于proteus mirabilis的l-氨基酸脱氨酶基因为模板，将该酶命名为pm473，以pet-20b为载体，以sali-xhoi为克隆位点，重组转化到大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中获得重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet20b-pm473基因工程菌。

3、在本发明的另一方面，本发明提出了一种重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌的构建方法。根据本发明的实施例，以来源于proteus mirabilis的l-氨基酸脱氨酶基因genebank:mg746627.1为模板，将该酶命名为pm473，以sali-xhoi为克隆位点将pm473插入到pet-20b载体中，通过pcr扩增技术，得到重组表达质粒pet20b-pm473，将重组表达质粒pet20b-pm473转化到大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)中，经过氨苄青霉素抗性筛选、酶切、菌液pcr和sds-page验证后获得重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet20b-pm473基因工程菌。

4、在本发明的另一方面，本发明提出了一种l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂。根据本发明的实施例，所述全细胞催化剂为所述的重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌的全细胞菌体。

5、在本发明的另一方面，本发明提出了一种l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂的制备方法。根据本发明的实施例，所述制备方法包括以下步骤：将权利要求1所述的重组l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌基因工程菌接种到含有氨苄青霉素的lb培养基中，培养得到种子液，将种子液中加入到含有氨苄青霉素的tb培养基中进行培养、诱导产酶，将诱导发酵后的菌悬液离心，使用na2hpo4-nah2po4缓冲液振荡清洗，再次离心后得到l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞菌体，即为l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂，将所述全细胞菌体保存于上述na2hpo4-nah2po4缓冲液中。

6、另外，根据本发明上述实施例的一种l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：

7、在本发明的一些实施例中，所述基因工程菌按体积分数0.5％～1％的接种量接种到含有100～200μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，转速200～250r/min，在30～40℃下培养10～14小时；所述种子液按体积分数0.5～1％接种量接种到含有100～200μg/ml氨苄青霉素的tb培养基中，放置于30～40℃下摇床培养；当加入新的tb培养基中富集培养的菌液od600在1.6～2.0时，加入0.05～0.5mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，iptg)，15～25℃范围内诱导发酵10～14小时；所述离心的温度为4～30℃，转速为8000～10000r/min，时间为10～15min；所述na2hpo4-nah2po4缓冲液的ph为6.0～8.0，浓度为0.01～0.05mol/l。

8、在本发明的另一方面，本发明提出了一种α-酮酸的制备方法。根据本发明的实施例，以氨基酸为底物，利用权利要求3所述的l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂进行催化脱氨生成相应的α-酮酸。

9、另外，根据本发明上述实施例的一种α-酮酸的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：

10、在本发明的一些实施例中，所述氨基酸为混旋谷氨酰胺、l-丙氨酸、l-苏氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸中的一种，分别得到α-酮戊二胺酸、丙酮酸、2-酮基3-羟基丁酸、苯丙酮酸、2-酮基-3-巯基丙酸。

11、在本发明的一些实施例中，具体包括以下步骤：以氨基酸为底物，利用na2hpo4-nah2po4缓冲液溶解底物，加入l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂进行反应，取出反应液后使酶失活，然后离心，离心后保留上清反应液弃去沉淀，所述上清反应液即为α-酮戊二胺酸。

12、在本发明的一些实施例中，当氨基酸为混旋谷氨酰胺时，所述氨基酸的浓度为40mmol/l，na2hpo4-nah2po4缓冲液的ph为6.5，浓度为0.02mol/l，反应温度为30℃；当氨基酸为l-丙氨酸、l-苏氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸中的一种时，所述氨基酸的浓度为20mmol/l，na2hpo4-nah2po4缓冲液的ph为7，浓度为0.02mol/l，反应温度为37℃；l-氨基酸脱氨酶大肠杆菌全细胞催化剂的终浓度为5g/l。

13、在本发明的一些实施例中，所述反应的时间为12小时，在220r/min的摇床进行反应；使酶失活采用高温加热的方法，高温加热的温度为100℃，加热时间为10～15min；离心的转速为8000～10000r/min，时间为10～15min。

14、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

15、1)l-氨基酸脱氨酶(l-amino acid deaminase，laad)是一种膜结合的核黄素氧化酶，该酶利用核黄素(flavin adenine dinucleotide，fad)催化氨基酸的脱氨基，产生相应的酮酸和氨，被还原的辅助因子的电子被转移到细胞色素上，因而不产生过氧化氢。本发明通过在大肠杆菌中表达来源于proteus mirabilis的l-氨基酸脱氨酶，通过微生物转化技术生产α-酮戊二胺酸，同时实现了对混旋谷氨酰胺的手性拆分。

16、2)当以混旋谷氨酰胺为底物时，利用本发明的全细胞催化剂，无需额外的辅因子即可获得α-酮戊二胺酸产物，同时得到d-谷氨酰胺单一手性对映体，以实现对谷氨酰胺的手性拆分，l-氨基酸脱氨酶全细胞催化混旋谷氨酰胺的酶活为1126μg/g.min。反应14h时，可实现l-谷氨酰胺转化率为100％，d-谷氨酰胺底物转化率为58.5％，总体剩余20.75％d-谷氨酰胺单一手性对映体。继续反应到20h，可以使总体转化率达到100％，底物全部转化为α-酮戊二胺酸。

17、3)本发明构建的e.coli bl21(de3)/pet20b-pm473基因工程菌催化谷氨酰胺所得产物较少，只有α-酮戊二胺酸和nh3，不会产生有害的h2o2，分离纯化简单。

18、4)本发明的全细胞催化剂还可以催化l-丙氨酸、l-苏氨酸、苯丙氨酸以及半胱氨酸，特异生产丙酮酸、2-酮基3-羟基丁酸、苯丙酮酸和2-酮基-3-巯基丙酸，简化了分离纯化步骤，降低了生产成本，为更好的生产α-酮酸提供了一种新的方式。