一种仿生类肽防冰抗冻剂及其制备方法和应用

本发明属于生物高分子合成领域，具体涉及一种仿生类肽防冰抗冻剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、水在低温下冻结成冰会对人们的生活和工业生产造成重大干扰，例如在超低温保存过程中形成的冰晶会极大地损伤细胞和器官，导致生物功能丧失。因此，防止冰晶的形成和生长非常重要。防冻剂具有降低结冰温度、缩小冰晶尺寸及防止冰重结晶等作用。

2、极寒地区生物体内的天然抗冻蛋白(afp)具备良好的抗冻效果，其是一种可调节冰核和冰晶生长的生物防冻材料，使得鱼类、微生物等能免受冰冻损伤而生存在0℃以下的环境中。afp可以防止细胞和体液中形成大冰粒，从而将体液保持在液体状态。但是，从生物体中提取afp是非常困难且昂贵的，且afp易降低细胞活力、引发排斥反应和造成生物危害，这限制了其在生产生活中的应用。因此，科研人员将重心转移到成本较低的人工合成抗冻剂。现有的常用抗冻剂，如聚乙烯醇、二甲基亚砜等，虽然具有一定的抗冻效果，但是效率不高，且具有一定的毒性，并不适合大量广泛应用，特别是在生物医药、食品加工等领域。所以亟需研制出理想的高效低毒的抗冻材料，使其能有效应用于生物相关领域，特别是低温冷冻保存领域。

3、类肽是与多肽拥有相似主链结构的n-取代聚甘氨酸，是模拟肽的聚合物，区别在于类肽主链结构上取代基从多肽的α-碳上转移到了n原子上，这样的差异消除了骨架上的链间、链内氢键及主链的手性，使得类肽的空间构象被侧链的电子作用和位阻效应所控制，从而更易形成无规卷曲结构，在大多数溶剂中具有良好的溶解性。此外，聚类肽还具有良好的热加工性及优异的生物相容性，可广泛应用于生物医学、化学催化及纳米材料等领域。

4、本发明以类肽为原材料，模拟天然抗冻蛋白结构，使用固相亚单体合成法，制成了同时具有亲水侧链和疏水侧链的两亲性聚类肽。所制备的聚类肽不仅具有优异的防冰抗冻性能，而且对细胞无毒害，有较好的生物相容性。此外，与最常用的防冻剂dmso相比，该类肽抗冻剂具有更好的防冻性能和更高的生物安全性，因此可广泛应用于生物医药、生命健康、环境保护等领域。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的防冰抗冻剂成本高、不稳定、有毒害等缺陷，本发明提供了一种仿生类肽防冰抗冻剂及其制备方法和应用；本发明所述仿生类肽防冰抗冻剂以含羟基侧链作为亲水侧链、烷基链作为疏水侧链，通过固相亚单体合成法按照设计的结构合成得到含有不同亲疏水序列的仿生类肽防冰抗冻剂；所述仿生类肽防冰抗冻剂能够与冰晶表面形成氢键相互作用抑制水分子运动、疏水烷基通过疏水作用来影响及阻止水分子聚集，进而能有效调控冰晶生长。

2、本发明首先提供了一种仿生类肽防冰抗冻剂，所述仿生类肽防冰抗冻剂的结构式如下所示：

3、

4、其中，n为0～4,m为0～4,v为1～6,w为1～6，x为1～6。

5、本发明还提供了上述仿生类肽防冰抗冻剂的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)溶胀：向酰胺树脂中加入n，n'-二甲基甲酰胺(dmf)进行溶胀，氮气鼓泡搅拌后抽滤；

7、(2)去保护：向步骤(1)所得产物中第一次加入4-甲基哌啶/dmf溶液，氮气鼓泡后抽滤，洗涤；然后向其中第二次加入4-甲基哌啶/dmf溶液，氮气鼓泡后抽滤，洗涤，得到去保护的树脂；

8、(3)nh2-(ch2)n-ch3的取代：

9、酰化：向步骤(2)中去保护的树脂中加入溴乙酸/dmf溶液和n，n'-二异丙基碳二亚胺溶液进行酰化反应，反应过程中通氮气鼓泡，反应结束后抽滤，洗涤，得到产物a；

10、nh2-(ch2)n-ch3取代：向产物a中加入nh2-(ch2)n-ch3进行取代反应，反应过程中通氮气鼓泡，反应结束后抽滤，洗涤，得到产物b；

11、将产物b按设计的结构依次重复酰化和nh2-(ch2)n-ch3取代的操作v-1次，得到产物c；

12、(4)nh2-(ch2)m-ch2o-thp的取代：

13、酰化：将产物c进行步骤(3)中的酰化反应，得到产物d；

14、nh2-(ch2)m-ch2o-thp取代：向产物d中加入nh2-(ch2)m-ch2o-thp溶液进行取代反应，反应过程中通氮气鼓泡，反应结束后抽滤，洗涤，得到产物e；

15、将产物e按设计的结构依次重复酰化和nh2-(ch2)m-ch2o-thp取代的操作w-1次，得到产物f；

16、(5)将产物f按设计的结构依次重复酰化和nh2-(ch2)m-ch2o-thp取代中的操作x-1次，然后dmf和二氯甲烷洗涤，晾干，密封置于冷冻保存，得到产物g；

17、(6)裂解：在产物g中加入裂解液，搅拌，抽滤然后通氮气吹干得到所述仿生类肽防冰抗冻剂的粗产物。

18、优选地，步骤(1)中，所述酰胺树脂和n，n'-二甲基甲酰胺的用量比为100mg:2ml；

19、所述溶胀时间为10min。

20、优选地，步骤(2)中，所述4-甲基哌啶/dmf溶液中，4-甲基哌啶与dmf的体积比为1:4；

21、所述第一次加入4-甲基哌啶/dmf溶液与第二次加入4-甲基哌啶/dmf溶液的体积比为1:1；

22、第一次加入4-甲基哌啶/dmf溶液时，鼓泡2min，抽滤，dnf洗涤；第二次加入4-甲基哌啶/dmf溶液时，鼓泡12min，抽滤，dmf洗涤。

23、优选地，步骤(3)中，所述nh2-(ch2)n-ch3中n为0～4；

24、所述溴乙酸/dmf溶液、n，n'-二异丙基碳二亚胺溶液、nh2-(ch2)n-ch3溶液和步骤(1)的酰胺树脂的用量比为1ml：86μl：1ml：100mg；

25、所述溴乙酸/dmf溶液的浓度为0.6m；所述nh2-(ch2)n-ch3的浓度为1m；

26、所述酰化反应的时间为5-30min；

27、所述取代反应的时间为5-60min；

28、所述v为1～6。

29、优选地，步骤(4)中，所述nh2-(ch2)m-ch2o-thp中m为0～4；

30、所述nh2-(ch2)m-ch2o-thp溶液与步骤(3)中的nh2-(ch2)n-ch3溶液的体积比为1:1；

31、所述nh2-(ch2)m-ch2o-thp的浓度为1m；所述取代反应的时间为5-60min。

32、所述w为1～6。

33、优选地，步骤(5)中，所述x为1～6。

34、优选地，所述裂解液包括三异丙基硅烷、纯水及三氟乙酸的混合溶液，所述混合溶液中三异丙基硅烷、纯水及三氟乙酸的体积比为2.5:2.5:95；所述搅拌的时间为10min-3h。

35、本发明还提供了上述仿生类肽防冰抗冻剂作为抗冻剂用于细胞、组织、器官或冷冻食品的低温冷冻保存中的应用。

36、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

37、(1)本发明设计制备了分子量可控、结构高度可设计的两亲性类肽低聚物；所述两亲性类肽低聚物以含羟基侧链作为亲水侧链、烷基链作为疏水侧链，通过固相亚单体合成法按照设计的结构合成得到含有不同亲疏水序列；所述两亲性类肽低聚物拥有改变冰晶形貌及降低冰晶生长速率的效果，具有相比dmso拥有更好的冰重结晶抑制活性，可以作为仿生类肽防冰抗冻剂。

38、(2)本发明制备过程具备操作方便，循环性好，准确度高等特征；

39、(3)本发明的仿生类肽防冰抗冻剂在生物医药、低温保存等方面具有广阔的应用前景；

40、(4)本发明所述仿生类肽防冰抗冻剂在制备过程中使用包括三异丙基硅烷、纯水及三氟乙酸的混合溶液的作为裂解液，其对产物分子的完整性没有影响，且能够顺利切除载体。