一种基于鲵皮肤分泌物的载细胞的水凝胶微球及其应用

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种基于鲵皮肤分泌物的载细胞的水凝胶微球及其应用。

背景技术：

1、创面修复是一个复杂的动态过程，涉及多种细胞内和细胞间通路，以及恢复组织的完整性和自身稳定性。这一动态过程包括炎症、增殖、上皮化、血管生成和胶原基质的形成，总结起来，创面修复可分为三个阶段：炎症反应、细胞增殖和分化，以及组织重塑。大面积全层创面往往难以修复，严重影响人体健康，甚至威胁生命。目前，临床上治疗皮肤缺损的标准方法是自体皮肤移植。但是由于移植组织取自患者，这种方法对患者会造成二次损伤，这不仅增加了患者的痛苦，而且容易带来供体部位感染等并发症的风险。

技术实现思路

1、第一方面，本发明提供了一种水凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

2、s1将甲基丙烯酰化明胶和光引发剂分散于水中并加热，得到第一凝胶溶液；

3、s2将鲵皮肤分泌物水解液加入至所述第一凝胶溶液，得到第二凝胶溶液，其中所述第一凝胶溶液和所述鲵皮肤分泌物水解液的体积比包括9:1-2:3；

4、s3将所述第二凝胶溶液和油相溶液分别注入微流控装置的水相通道和油相通道，所述第二凝胶溶液被所述油相溶液切成单分散微球；

5、s4将所述单分散微球进行光固化交联，得到水凝胶微球。

6、在一些实施例中，所述甲基丙烯酰化明胶的浓度包括10％-12.5％(w/v)。

7、生物材料的选择对于组织工程的细胞功能调控至关重要。天然水凝胶(例如海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、壳聚糖、胶原蛋白、纤维蛋白、聚乙二醇)在组织工程中引起了相当大的关注。然而，大多数水凝胶受到机械性能差和细胞附着有限的限制。本发明采用的甲基丙烯酰化明胶，由明胶与甲基丙烯酸酐(ma)反应制备而成，具有生物相容性好(包括生物安全性和生物功能性)、细胞粘附性强、理化性质可调等一系列优点。

8、在一些实施例中，所述油相溶液包括矿物油和失水山梨醇油酸酯。

9、在一些实施例中，所述矿物油和所述失水山梨醇油酸酯的体积比包括9:1。

10、在一些实施例中，所述鲵皮肤分泌物水解液的浓度包括5％-10％(w/v)。

11、在一些实施例中，所述s3中所述第二凝胶溶液的进样速度包括20μl/min，所述油相溶液的进样速度包括400-700μl/min。

12、微流控技术可以通过操纵和控制多种不混溶液体的流动来快速生成尺寸可调的单分散微凝胶。本发明利用微流控技术，以高通量的方式制备了尺寸可调、大小均一的单分散水凝胶微球。本发明制备的水凝胶微球是一种三维交联的聚合物网络，具有良好的结构特性，包括高水分、高弹性、多孔结构以及对氧气和代谢物的良好渗透性，能够很好地模拟天然细胞外基质。除此之外，本发明制备的水凝胶微球的结构稳定性高、尺寸均匀、可注射性高，适用于多种场景。除此之外，本发明的水凝胶微球体积小，可以通过小针头和导管注射，并吸入颗粒，这有利于细胞和生物制品的微创输送。

13、在一些实施例中，所述光引发剂包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂或钌(ru)。

14、在一些实施例中，所述光引发剂的浓度包括0.25％(w/v)。

15、在一些实施例中，所述加热的加热时间≥30min，所述光固化交联的时间≥3min。

16、第二方面，本发明提供了通过上述方法制得的所述水凝胶微球。

17、在一些实施例中，所述水凝胶微球的直径包括150～300μm。

18、在一些实施例中，所述水凝胶微球的直径包括200～250μm。

19、第三方面，本发明提供了上述水凝胶微球在制备可注射制剂中的用途，其特征在于，所述可注射制剂用于促进组织再生。

20、在一些实施例中，所述组织包括皮肤、骨和牙髓中的一种或多种。

21、在一些实施例中，所述可注射制剂用于皮下注射、关节腔内注射和牙髓内注射中的一种或多种。

22、第四方面，本发明提供了一种载细胞的水凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

23、s1将甲基丙烯酰化明胶和光引发剂分散于水中并加热，得到第一凝胶溶液；

24、s2将鲵皮肤分泌物水解液加入至所述第一凝胶溶液，得到第二凝胶溶液，其中所述第一凝胶溶液和所述鲵皮肤分泌物水解液的体积比包括9:1-2:3；

25、s3将所述第二凝胶溶液和油相溶液分别注入微流控装置的水相通道和油相通道，所述第二凝胶溶液被所述油相溶液切成单分散微球；

26、s4将所述单分散微球进行光固化交联，得到水凝胶微球；

27、s5将干细胞与所述水凝胶微球共培养，得到所述载细胞的水凝胶微球。

28、在一些实施例中，所述方法进一步包括去除所述水凝胶微球中残留的所述油相溶液的步骤，所述步骤在所述s4后、所述s5前进行。

29、在一些实施例中，所述干细胞包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙髓干细胞中的一种或多种。

30、干细胞具有持续增殖和多向分化的潜能。本发明以脐带间充质干细胞(uc-mscs)为例，制备了具有促进组织修复和再生能力的载细胞的水凝胶微球。除此之外，还可以采用其他具有自我更新和多分化潜能的干细胞，例如骨髓间充质干细胞(bmscs)、脂肪干细胞(adscs)和牙髓干细胞。

31、在一些实施例中，所述共培养的时间包括3-7天。

32、第五方面，本发明提供了通过上述方法制得的载细胞的水凝胶微球。

33、第六方面，本发明提供了上述载细胞的水凝胶微球在制备用于穴位点注射的皮下注射剂中的用途，其特征在于，所述皮下注射剂用于促进皮肤伤口愈合。

34、在一些实施例中，所述穴位点包括心俞、脾俞、肾俞和足三里。

35、在一些实施例中，所述伤口包括全层伤口。

36、在一些实施例中，本发明通过穴位点(不是其他点注射，也不是普通针灸)注射上述载细胞的水凝胶微球，其能够在穴位点缓释干细胞并起到局部长刺激的作用，促进了全层皮肤缺损伤口的愈合。

37、有益效果

38、本发明通过将鲵皮肤分泌物水解液与gelma混合，形成了一种新型水凝胶，并利用微流控设备将这种水凝胶切成均匀一致的水凝胶微球。经实验验证，本发明提供的水凝胶微球具有良好的生物相容性和可降解性，可以作为良好的可注射微型生物支架，通过微创的方法被精准地输送到生物体内。本发明提供的水凝胶微球能够为细胞的粘附和增殖提供良好的三维平台和促进组织再生。在上述水凝胶微球上荷载了干细胞(例如人脐带间充质干细胞)形成的载细胞的水凝胶微球，能够促进皮肤创面的修复再生和提高创面修复效率(包括最早实现创面闭合及再上皮化、新生的胶原纤维更加成熟、真皮层有更多的皮肤附属器的再生、形成的瘢痕更小等)。类似地，经实验验证，本发明提供的水凝胶微球还能够促进骨和牙髓再生。

39、在一些实施例中，本发明通过向sd大鼠全层皮肤缺损模型的穴位点注射载细胞的水凝胶微球，结果发现，本发明提供的载细胞的水凝胶微球可通过皮下注射的方式(例如注射针输送到穴位并长时间刺激穴位点)，能够显著促进创面修复，使创面修复效率更高，修复效果更佳(修复效果优于常规的穴位点埋线(传统的可吸收胶原蛋白线)。

40、如本文所使用，术语“水凝胶”是指具有高吸收性(例如，可以吸收和/或保留大量体积的水)的天然或合成聚合物网络。

41、如本文所使用，术语“水凝胶微球”是指具有高水分的三维交联的聚合物网络且具有微球形态的物质，其直径大约为100-400μm。

42、如本文所使用，术语“生物组织”或“组织”是指活体或死亡生物体的任何组织或源自活体或死亡生物体的任何组织。生物组织可以包括任何单一组织(例如，可以被互连的细胞的集合)或组成生物体的器官或部分或区域的一群组织。生物组织包括结缔组织(例如，网形结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、疏松结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。不同的生物组织可以形成特定功能的器官。生物组织相关或来源的生物体(即，受试者或个体)可以是任何动物，包括哺乳动物和非哺乳动物(例如无脊椎动物)。生物组织可以是完整的，或者可以具有一个或多个切口、裂痕、缺损或其他的类型的伤口。在一些实施例中，生物组织为哺乳动物的组织。

43、如本文所使用，“伤口”、“创口”或“创面”可互换地使用，指的是组织结构的连续性或完整性的物理破坏。伤口可能是由于切割、擦伤、撕脱伤、撕裂伤、穿刺、癌症、糖尿病性溃疡或病变、烧伤、手术或其他损伤造成的。在一些实施例中，伤口可能导致出血。

44、如本文所使用，“伤口愈合”或“伤口修复”是指组织完整性的部分或完全恢复。在一些实施例中，伤口愈合包括时间上和空间上的愈合程序，所述程序包括伤口闭合和涉及伤口闭合的过程。在一些实施例中，所述组织为皮肤，即伤口是皮肤伤口，例如真皮或表皮伤口。“促进伤口愈合”应理解为使皮肤组织从连续性或完整性的中断中恢复，具体涉及使皮肤(真皮和表皮)、其下面的结缔组织、附属器中的一种或多种恢复或部分恢复。在一些实施例中，促进伤口愈合包括达到相同的愈合程度，所需愈合时间更短。在一些实施例中，促进伤口愈合包括在相同愈合时间内，达到的愈合程度更高。具体可能涉及：新血管形成；成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞迀移；细胞外基质沉积；表皮再植；以及重塑中的一种或多种。

45、如本文所使用，“全层伤口”是指表皮和真皮以及更深的结构(例如真皮血管)的破坏。

46、如本文所使用，术语“伤口闭合”是指伤口的封闭，包括关闭伤口并不使内部组织暴露。在一些实施例中，所述伤口闭合包括伤口的侧边重新接合以形成连续的屏障物(例如完好的皮肤)。在一些实施例中，所述伤口闭合还包括止血。

47、如本文所使用，“瘢痕”是指由创伤后所引起的组织的外观形态和组织病理学改变，其是机体创伤修复过程中必然产物。瘢痕生长超过一定的限度时，可能会发生各种并发症(例如外形的破坏及功能活动障碍等)，给患者带来巨大的肉体痛苦和精神痛苦(尤其是烧伤、烫伤、严重外伤后遗留的瘢痕)。“无瘢痕愈合”是指少于、明显少于或不存在伤口自然愈合所形成的瘢痕。

48、如本文所使用，术语“生物相容性”是指在其预期使用的体内环境中基本无毒，并且基本不会被个体的生理系统排斥的材料。评价生物材料的生物相容性应遵循生物安全性和生物功能性两个原则，既要求生物材料具有很低的毒性，同时要求生物材料在特定的应用中能够恰当地激发机体相应的功能(例如，材料与机体环境相互作用)。在一些实施例中，所述生物相容性满足fda的要求。体内的免疫反应和组织修复过程十分复杂，通过一种细胞或组织确定某种材料的生物相容性往往是不够的。本发明参考国际标准化组织(international standards organization，iso)10993和国家标准gb/t16886的要求，通过一系列体外、体内实验验证了本发明提供的水凝胶微球对生物体(特别是伤口环境)具有较高的生物相容性。

49、如本文所使用，“再生”是组织或器官受外部作用而部分缺失，在剩余部分的基础上又生长出与缺失部分在形态和/或功能上相同的结构的修复过程。

50、如本文所使用，“生物来源的”是指源自或取自天然存在的有机体和有机体的部分。换句话说，本发明涉及的鲵皮肤分泌物冻干粉和鲵皮肤分泌物水解液并非是通过基因重组技术获得的。

51、本发明涉及的缩写：

52、h-ucmscs：human umbilical cordmesenchymal stem cells，人脐带间充质干细胞；ssad：skin secretion ofandrias davidianus，大鲵皮肤分泌物；bsa：bovine serumalbumin，牛血清白蛋白；ecm：extracellular matrix，细胞外基质；pbs：phosphate buffersaline，磷酸缓冲盐溶液；sem：scanning electron microscope，扫描电子显微镜；α-mem：minimum essential medium-α，α-基础培养基；cck8：cell counting kit-8，细胞增殖计数试剂盒；h&e：hematoxylin-eosin staining，苏木精-伊红染色；gelma：methacrylategelatin，甲基丙烯酰化明胶；lap：lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate，苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂；ma：methacrylicanhydride，甲基丙烯酸酐；fbs：fetal bovine serum，胎牛血清；hrp：horseradishperoxidase，辣根过氧化物酶；dmso：dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜。