组织裂解用组合物及组织裂解制备单细胞的方法和应用与流程

本发明涉单细胞检测，具体涉及一种组织裂解用组合物及组织裂解制备单细胞的方法和应用。

背景技术：

1、子宫参与内分泌，能够保护卵巢、防止细菌感染。子宫是产生生命的“摇篮”，受精卵在子宫内着床，发育成胎儿，如果子宫功能受损可导致胚胎和胎盘形成问题，最终导致流产或多胎妊娠并发症如先兆子痫，宫内生长受限和早产。

2、近年来，新一代单细胞测序技术(single cell sequencing)已经相对成熟。以小鼠子宫为模型，可以针对小鼠子宫的数千个细胞在单细胞水平上进行高通量测序和分析，快速确定成千上万个细胞的基因表达模式，在这种分辨率下，可以深入了解子宫内环境下细胞多样性的特征以及区分不同细胞群的生物学特征。其中，单细胞测序最关键的步骤是组织裂解成单细胞。组织裂解的效果好坏可直接影响测序数据质量。

3、目前，常规单独采用胶原酶或者中性蛋白酶酶解子宫组织，存在酶解时间长、酶解效率低、细胞活率低等问题。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种组织裂解用组合物及组织裂解制备单细胞的方法和应用，同步提升酶解效率和细胞活率。

2、本发明采用如下技术方案：

3、本发明提供一种组织裂解用组合物，包括胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶。具体地，胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶的工作浓度比例选自(0.5～30)mg/ml:(0.1～25)mg/ml:(0.1～25)mg/ml:(0.02～0.5)mg/ml:(0.05～0.5)mg/ml。

4、优选地，胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶的工作浓度比例为(0.5～5)mg/ml:(0.1～5)mg/ml:(0.1～5)mg/ml:(0.02～0.1)mg/ml:(0.05～0.25)mg/ml。

5、更优选地，胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶的工作浓度比例为0.8mg/ml:1mg/ml:1.2mg/ml:0.02mg/ml:0.25mg/ml。

6、进一步地，所述组织裂解用组合物还包括裂解缓冲液。优选地，所述裂解缓冲液选自rpmi 1640培养基缓冲液、含5％胎牛血清的rpmi 1640培养基缓冲液、磷酸盐缓冲液、含5％胎牛血清的磷酸盐缓冲液和/或红细胞裂解液。

7、本发明还可以提供一种组织裂解试剂，包括上述组织裂解用组合物。

8、本发明还可以提供一种组织裂解制备单细胞的方法，包括如下步骤：

9、将胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶ⅰ均匀分散于rpmi 1640培养基缓冲液中，得混合酶液1；将胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ和脱氧核糖核酸酶ⅰ均匀分散于含5％胎牛血清的rpmi 1640培养基缓冲液中，得混合酶液2；

10、将组织切块，置于含混合酶液1中，4℃消化，静置分层，得上层清液1样本和下层组织碎块1样本；将所述下层组织碎块1样本与所述混合酶液2混合，37℃消化，静置分层，得清液2样本；合并清液1样本和清液2样本，细胞筛过滤，滤液置于4℃、500g条件下离心，去上清，得一级沉淀样本；向所述一级沉淀样本中加入磷酸缓冲液重悬，并加入红细胞裂解液进一步裂解，离心去上清，得二级沉淀样本；向所述二级沉淀样本中加入磷酸缓冲液重悬，再次离心，去上清，重悬沉淀，即得单细胞样品。

11、在其中一些实施例中，所述组织为动物子宫组织。

12、本发明还可以提供上述组织裂解用组合物或者上述组织裂解试剂在单细胞测序方法中的应用。

13、与现有技术相比，本发明的核心优势在于：

14、本发明通过大量筛选探索，发现采用胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶以特定工作浓度配合用于组织细胞裂解制备单细胞时，可以整体达到缩短小鼠子宫等组织的裂解时间、促进充分裂解组织并提高裂解后细胞活率的综合技术效果。

技术特征：

1.一种组织裂解用组合物，其特征在于，包括胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的组织裂解用组合物，其特征在于，胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶的工作浓度比例为(0.5～30)mg/ml:(0.1～25)mg/ml:(0.1～25)mg/ml:(0.02～0.5)mg/ml:(0.05～0.5)mg/ml。

3.根据权利要求2所述的组织裂解用组合物，其特征在于，胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶的工作浓度比例为(0.5～5)mg/ml:(0.1～5)mg/ml:(0.1～5)mg/ml:(0.02～0.1)mg/ml:(0.05～0.25)mg/ml。

4.根据权利要求3所述的组织裂解用组合物，其特征在于，胶原酶ⅰ、胶原酶ⅳ、中性蛋白酶ⅰ、脱氧核糖核酸酶ⅰ和胰蛋白酶的工作浓度比例为0.8mg/ml:1mg/ml:1.2mg/ml:0.02mg/ml:0.25mg/ml。

5.根据权利要1至4任一项所述的组织裂解用组合物，其特征在于，还包括裂解缓冲液。

6.根据权利要5所述的组织裂解用组合物，其特征在于，所述裂解缓冲液选自rpmi1640培养基缓冲液、含5％胎牛血清的rpmi 1640培养基缓冲液、磷酸盐缓冲液、含5％胎牛血清的磷酸盐缓冲液和红细胞裂解液。

7.一种组织裂解试剂，其特征在于，包括权利要求1至6任一项所述的组织裂解用组合物。

8.一种组织裂解制备单细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述的组织裂解制备单细胞的方法，其特征在于，所述组织为子宫组织。

10.权利要求1至6任一项所述的组织裂解用组合物或者权利要求7所述的组织裂解试剂在单细胞测序方法中的应用。

技术总结
本发明提供一种组织裂解用组合物及组织裂解制备单细胞的方法和应用。当采用胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅳ、中性蛋白酶Ⅰ、脱氧核糖核酸酶Ⅰ和胰蛋白酶以特定工作浓度配合用于组织细胞裂解制备单细胞时，可以整体达到缩短小鼠子宫等组织的裂解时间、促进充分裂解并提高裂解后细胞活率的综合技术效果。

技术研发人员：陈贻军,周雪,李彬,朱琳,陆亚平,郭琼钰,王蓉,李拼
受保护的技术使用者：国药（武汉）精准医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13