一种沙门菌突变株及其产生的抗幽门螺杆菌感染外膜囊泡

本发明属于基因工程和抗幽门螺杆菌感染领域，具体涉及一种沙门菌突变株及其产生的抗幽门螺杆菌感染外膜囊泡。

背景技术：

1、幽门螺杆菌是由barry j.marshall和j.robin warren二人发现，感染幽门螺杆菌之后产生的症状主要是反酸、烧心以及胃痛、口臭；感染幽门螺杆菌还能引发慢性胃炎，虽然病程缓慢，但易反复发作。

2、目前，针对幽门螺杆菌感染的治疗方式，除了采用三联疗法(质子泵抑制剂或铋剂联合两种抗生素)和四联疗法(铋剂、质子泵抑制剂和两种抗生素)之外，常见的治疗药物还有某些天然药物，如cn101209271b中公布的药物组合物。近些年来，偶有采用一些菌剂实现对幽门螺杆菌感染的防治效果，如cn102174450b公布了一种抗幽门螺杆菌感染的植物乳杆菌。由此可知，目前对于抗幽门螺杆菌感染的手段还相对有限，亟需更多的替代治疗方案。

3、外膜囊泡由于具有比活细菌更具优势的免疫刺激能力，其作为疫苗及递呈载体越来越受到研究人员的关注，其一方面可以避免活细菌载体的安全风险，另一方面由于其脂质双分子层的特性可以包裹所递呈的小分子药物不被机体过快清除。在利用外膜囊泡实现相关病原菌感染的研究方面，目前尚处于起步阶段，仅有零星报道，如cn111793591b采用突变株的外膜囊泡实现了对贺氏菌感染的防治。

4、综上所述，如何构建相关的突变株，并利用其外膜囊泡实现对幽门螺杆菌感染的防治，是本领域所亟需解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的缺点和需求，本发明的目的在于提供一株沙门菌突变株，该突变株产生的外膜囊泡具有良好的抗幽门螺杆菌感染的效果。

2、为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种沙门菌突变株，所述突变株发生δrfbp、δflic、δfljb和δompa基因缺失突变，其递呈同时表达ureb和caga抗原。

4、作为本发明的一个实施方案，所述突变株的分类命名为鼠伤寒沙门菌qs0074salmonella tpyhimurium qs0074，保藏号为cctcc m 2023192，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2023年2月24日。

5、作为本发明的一个实施方案，所述ureb和caga抗原由hbp蛋白自转运系统表达；基因rfbp的核苷酸序列如seq id no.1所示，基因flic的核苷酸序列如seq id no.2所示，基因fljb的核苷酸序列如seq id no.3所示，基因ompa的核苷酸序列如seq id no.4所示，基因ureb的核苷酸序列如seq id no.5所示，基因caga的核苷酸序列如seq id no.6所示，hbp自转运系统表达盒的基因核苷酸序列如seq id no.7所示。

6、本发明还提供了构建上述突变株的方法，所述构建方法包括如下步骤：

7、(1)通过同源重组的方法，敲除基因rfbp、基因flic、基因fljb、和基因ompa；

8、(2)通过转入表达质粒的方法，利用hbp蛋白自转运系统将ureb和caga抗原的基因表达片段构建于质粒中，并将质粒通过电转的方式转入沙门菌中，最终构建得到所述沙门菌突变株；

9、优选地，所述表达质粒为pya3332模板质粒；

10、更优选地，所述步骤(2)所述质粒的构建方法包括如下步骤：

11、<1>将来源于鼠伤寒沙门菌自身的hbp自转运系统表达盒利用gibson assemblykit组装试剂盒一步法克隆至载体pya3332中；

12、<2>利用gibson assembly kit组装试剂盒将肿瘤抗原ureb和caga抗原的编码基因序列分别克隆至hbp自转运系统表达盒中，以实现将两种抗原表达至突变株外膜表面。

13、作为本发明的一个实施方案，所述步骤(1)具体包括如下步骤：

14、<1>构建同源重组质粒pi11570-rfbp、pi11570-flic、pi11570-fljb、和pi11570-ompa；

15、<2>制备鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100感受态；

16、<3>将步骤<1>所得同源重组质粒通过电转的方式转化入鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100菌株感受态中，将电转杯移入电转仪，2500伏电击4毫秒；

17、<4>将电转杯中的液体转移至不含抗生素的沙门菌固体培养基上，微氧环境下培养48小时，传代至含有相应抗生素的培养基上培养48小时，再传至抗性培养基中培养48小时后，产生的单克隆即为电转成功的菌；

18、<5>通过pcr筛选得到不含rfbp、flic、fljb和ompa的突变菌株；

19、优选地，所述步骤<2>中鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100的制备方法包括如下步骤：

20、1>将鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100培养36-48h至对数期，取事先在冰上预冷过的电转液3ml于培养皿内，收集菌体1ml于洁净的1.5ml离心管中，使菌浓度调整为5×109cfu/ml；

21、2>6000rpm下，于4度低温离心5min，重复洗涤三次；

22、3>弃上清后将菌体重悬于预冷的1ml电转液中，将菌浓度调整为5×108cfu/ml，即制备好感受态备用。

23、作为本发明的一个实施方案，所述同源重组质粒pi11570-rfbp、pi11570-flic、pi11570-fljb、和pi11570-ompa的构建步骤为：

24、1)引物设计：

25、rfbp-1f：5’caactgataaaagtcaatcc3’

26、rfbp-1r：5’gtaagcttacctgcaggttaatcctcaccctctga3’

27、rfbp-2f：5’gattaacctgcaggtaagcttaccgagaagtactga3’

28、rfbp-2r：5’atacgacgaggcgtttcgag3’

29、flic-1f：5’cgttctttgtcaggtctgtc3’

30、flic-2r：5’gattagcggccgcgatcttttccttatcaatta3’

31、flic-2f：5’aagatcgcggccgctaatccggcgattgattcac3’

32、flic-2r：5’tgtacccggcacagacggtc3’

33、fljb-1f：5’agtgagctccacgttcatgt3’

34、fljb-1r：5’aattagcggccgcaaaattttccttttggaagg3’

35、fljb-2f：5’attttgcggccgctaatttatttcgttttattc3’

36、fljb-2r：5’gtcattacctgataattcttc3’

37、ompa-1f：5’catcctctcacacaacgagac3’

38、ompa-1r：5’ctgcaggaatgcggccgccgggggatctgctcaatatt3’

39、ompa-2f：5’cggccgcattcctgcaggtaagttatcgtctggtagaaaaac3’

40、ompa-2r：5’catatgaatccggaactggtc3’

41、2)提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100基因组dna作为模板，分别用左右同源臂引物进行扩增，得到其左右同源臂的扩增产物，回收产物分别利用引物上酶切位点进行酶切，即左同源臂用ecor i和pst i进行酶切，右同源臂用cla i、bamh i进行酶切，得到左右同源臂酶切后产物；

42、3)再分别对载体质粒进行酶切，将得到的载体酶切产物在t4连接酶的作用下分别与左右同源臂进行连接并转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pi11570-rfbp、pi11570-flic、pi11570-fljb、和pi11570-ompa。

43、作为本发明的一个实施方案，hbp自转运系统表达质粒载体的构建方法包括如下步骤：

44、<1>引物设计：

45、hbp-f:5’acgcgtatatgcaagtccaccggtttaag3’

46、hbp-r:5’ttcgagctgactgactgtaagcgtacagcctg 3’

47、<2>提取处于对数生长期的鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100基因组dna作为模板，以及以pya3332线性化质粒作为模板分别用对应引物进行扩增，分别得到对应片段的扩增产物，利用gibson assembly kit进行一步法克隆，将产物转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pya3332-hbp；

48、和/或，所述ureb和caga抗原的表达质粒的构建方法包括如下步骤：

49、<1>引物设计：

50、ureb-f:5’tgctgacaaagaactgggttctaccgcaatttttg3’

51、ureb-r:5’gaaacagttcctgagtcggcgttcgatcaccct3’

52、caga-f:5’tgccaccctgagtctgaacagcctactgattactttggtaac3’

53、caga-r:5’cgctgttacgacgcattgagacttaagatttctggaaaccac3’

54、pya3332-hbp-ureb-f:5’agggtgatcgaacgccatgacgtaactgacgattgc3’

55、pya3332-hbp-ureb-r:5’caaaaattgcggtagaaccagtaaaccttggcgacgtg3’

56、pya3332-hbp-caga-f:

57、5’gtggtttccagaaatcttaaagcgccggcctgaaggtaatc3’

58、pya3332-hbp-caga-r:5’gttaccaaagtaatcagtgcgccgagagcgattga3’

59、<2>利用引物ureb-f和ureb-r以鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100为模板扩增ureb对应的序列，利用引物pya3332-hbp-ureb-f和pya3332-hbp-ureb-r以pya3332-hbp为模板扩增载体片段，分别得到对应片段的扩增产物，利用gibson assemblykit进行一步法克隆，将产物转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pya3332-hbp-ureb；

60、<3>利用引物caga-f和caga-r以鼠伤寒沙门菌salmonella typhimurium s100为模板扩增caga对应的序列，利用引物pya3332-hbp-caga-f和pya3332-hbp-caga-r以pya3332-hbp-ureb为模板扩增载体片段，分别得到对应片段的扩增产物，利用gibsonassembly kit进行一步法克隆，将产物转化入大肠杆菌菌株top10中，得到重组质粒pya3332-hbp-ureb-caga。

61、本发明还提供了由上述突变株或者上述构建方法构建的突变株产生的抗幽门螺杆菌感染外膜囊泡。

62、本发明还提供了一种抗幽门螺杆菌感染的制剂，所述制剂包括上述的外膜囊泡。

63、本发明还提供上述外膜囊泡在制备抗幽门螺杆菌感染方面药物的应用。

64、本发明在研究的过程中，尝试了多种突变株的构建策略，如本发明的试验例所示，其它多种策略所得的外膜囊泡在抗幽门螺杆菌感染方面的效果普遍较差。例如敲除不同种类外膜蛋白ompa、ompc和ompd，或者将其组合敲除，其效果均不如ompa单敲诱导免疫反应能力强，同时将递呈的ureb替换为vaca，或者将递呈的caga替换为vaca，甚至同时递呈ureb、vaca和caga抗原，所得的抗幽门螺杆菌感染方面的效果均显著的低于本发明。

65、本发明的有益效果：

66、本发明所得突变株产生的外膜囊泡具有明显的抗幽门螺杆菌感染的效果，本发明为防治幽门螺杆菌感染提供了新的思路，具有良好的应用前景。