筛选赤霉病抗侵染小麦的KASP引物组及其应用的制作方法

本发明属于小麦分子育种方法，涉及筛选赤霉病抗侵染小麦的ka sp引物组及其应用。

背景技术：

1、赤霉病(fusarium head blight)是严重危害小麦产量和食用安全的世界性病害，主要由禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)等引起。小麦抗赤霉病的表现形式可分为5类：第一类为抗侵染、第二类为抗扩展；第三类为籽粒抗感染、第四类为耐病性、第五类为抗毒素积累。其中第一类和第二类是国内外学者长期以来致力研究的类型小麦。赤霉病抗侵染是宿主抵抗赤霉病菌的第一道屏障，对于赤霉病抗性育种更为重要。除品种本身的抗性外，小麦的农艺性状对赤霉病也具有一定的影响。株高较高，穗部与蕴藏病原菌的土壤表面相距较远，受侵染能力弱。小麦的矮秆基因rht-b1、rht-d1和rht8与赤霉病的抗性的关系报道较多，已有研究表明这3个位点的矮秆等位变异具有显著的提高赤霉病严重度的效应，其他矮秆基因与小麦赤霉病抗性的关系并未被充分研究。在生育期和小麦赤霉病的关系研究上，学者们在一定遗传背景下研究发现小麦生育期相关的基因或者位点对赤霉病抗性有显著性影响(zhu等，2021)。目前关于小麦抗侵染位点(quantitative traits loci，qtl)的报道较少，仅有分别是来自望水白4b染色体上的fhb4(xue等，2010)和5a染色体上的fhb5(xue等，2011)。望水白是一个小麦地方品种，株高偏高、易倒伏，生育期较长，作为抗赤霉病种质使用起来较困难。因此，从农艺性状较好的品种中挖掘出优良的赤霉病抗侵染位点对于抗赤霉病与高产的综合育种十分重要。扬麦4号与扬麦5号曾经是长江中下游麦区的主导品种，产量潜力高，农艺性状优异，赤霉病抗侵染性也很好，偃展1号是黄淮南部小麦品种，弱春性，矮杆大穗，产量高，农艺性状优异，易受赤霉病侵染，因此，利用扬麦4号/偃展1号和扬麦5号/偃展1号两个ril(recombinant inbred lines)群体可以挖掘扬麦4号和扬麦5号的赤霉病抗侵染位点，为小麦抗赤霉病育种提供基因资源。

2、kasp技术基于引物末端碱基的特异匹配和通用荧光探针对snp进行分型检测，荧光定量pcr仪或普通pcr仪结合酶标仪即可完成分型。kasp技术与taqman(检测寡核苷酸的荧光探针法)类似，都是基于终端荧光信号的读取判断，每孔反应都是采用双色荧光检测个snp位点的两种基因型，不同的snp对应着不同的荧光信号。但它不需要每个snp位点都合成特异的荧光引物，所有的位点检测最终都可以使用通用荧光引物进行扩增，这就降低了kasp技术的试剂成本，使其更具实用性。现代小麦中很多农艺性状或者抗病抗逆的相关基因/位点被挖掘或者精细定位后，研究者都会根据位点两侧的紧密连锁标记侧翼序列开发成kasp标记，方便育种家利用(su等，2018；zhang等，2020；胡文静等，2022)。kasp技术具有高通量、检测方便等优势(rasheed等，2019)。用snp芯片进行基因分型，通过qtl定位或gwas分析获得的与目标性状连锁的snp，可被转化成kasp标记，以方便应用于育种。(rasheed等，2019)开发了70个小麦功能基因kasp标记，已得到广泛应用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的缺陷，提供一种可供分子标记辅助选择赤霉病抗侵染基因型的小麦育种使用的连锁分子标记。本发明利用wheat 55ksnp小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于小麦品种扬麦4号和扬麦5号的与赤霉病抗侵染显著相关的qtl区域qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a，进一步通过筛选附近snp序列的有效性、可靠性，在这两个qtl峰值附近开发了2个kasp标记引物组，用以对赤霉病抗侵染基因型的小麦种质进行高效筛选。

2、第一方面，本发明提供了一种筛选赤霉病抗侵染小麦的kasp引物组，所述kasp引物组为用于检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是tt、还是gg、还是t和g的成套引物x1，和用于检测小麦基因组中染色体3a上seq idno.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是tt、还是cc、还是t和c的成套引物x2的组合。

3、进一步地，所述成套引物x1中含有两条上游引物和一条下游引物；

4、所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为t，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为g；

5、所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计，。

6、进一步地，所述成套引物x2中含有两条上游引物和一条下游引物；

7、所述上游引物根据所述小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸及其上游序列进行设计，且一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为t，另一条所述上游引物的3’末端脱氧核糖核苷酸为c；

8、所述下游引物根据所述小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示序列的第36位脱氧核糖核苷酸的下游序列进行设计。

9、进一步地，所述成套引物x1由所述上游引物序列seq id no.1、seq id no.2及所述下游引物的序列seq id no.3组成；所述成套引物x2由所述上游引物序列seq id no.5、seq id no.6及所述下游引物的序列seq id no.7组成。

10、本发明第二方面提供了上述的kasp引物组在如下任一中的应用：

11、(a)鉴定或辅助鉴定小麦的赤霉病抗侵染性状；

12、(b)比较待测小麦赤霉病抗侵染能力的强弱；

13、(c)选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；

14、(d)选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种；

15、(e)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的赤霉病抗侵染性状的产品；

16、(f)制备用于选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

17、(g)制备用于选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

18、本发明第三方面提供了如下任一方法：

19、方法a：一种比较待测小麦赤霉病抗侵染能力强弱的方法，包括如下步骤(a1)或(a2)：

20、(a1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；

21、(a2)按照如下确定所述待测小麦赤霉病抗侵染能力强弱：基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是gg且基因组中染色体3a上seq idno.8所示分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是cc的纯合体，所述待测小麦具有赤霉病抗侵染能力强；

22、方法b：一种选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

23、(b1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；

24、(b2)选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6b上seq idno.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体的小麦，最终获得赤霉病抗侵染能力相对较强的小麦单株或株系或品系或品种；

25、方法c：一种选育或筛选赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种的方法，包括如下步骤：

26、(c1)检测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示分子标记的第36位基因型是tt还是gg还是tg，同时检测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示分子标记的第36位基因型是tt还是cc还是tc；

27、(c2)选择基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体的待测小麦作为亲本进行选育，并在育种各世代选择基因组中染色体6b上seq idno.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t且基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体的小麦，最终获得赤霉病抗侵染能力相对较弱的小麦单株或株系或品系或品种。

28、进一步地，所述(a1)(b1)(c1)

29、具体操作为，

30、采用本发明第一方面所述的kasp引物组对待测小麦基因组dna进行pcr扩增，将所扩增的产物进行荧光信号扫描，对扫描数据进行分析，然后按照如下确定所述待测小麦基因中染色体6b上seq id no.4所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类和所述待测小麦基因中染色体3a上seq id no.8所示的的第36位脱氧核糖核苷酸种类；

31、若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为蓝色，则所述待测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是g的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是c的纯合体；

32、若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据显示为红色，则所述待测小麦基因组中染色体6b上seq id no.4所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体，或所述待测小麦基因组中染色体3a上seq id no.8所示的分子标记的第36位脱氧核糖核苷酸是t的纯合体。

33、本发明相对于现有技术而言，利用wheat 55ksnp小麦高通量基因芯片获取基因型数据，检测到来源于小麦品种扬麦4号和扬麦5号的与赤霉病抗侵染显著相关的qtl区域qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a，进一步通过筛选附近附近snp序列的有效性、可靠性，在这两个qtl峰值附近分别开发了2个kasp标记引物组，用以对赤霉病抗侵染基因型的小麦种质进行高效筛选。本发明为两个赤霉病抗侵染位点qfhi-yaas-y4-6b和qfhi-yaas-y5-3a在抗赤霉病育种中的有效利用提供了良好工具，这两个kasp标记可快速对小麦赤霉病抗侵染特性进行筛选，为筛选携带抗侵染优异等位变异的小麦材料提供便捷，提高小麦抗赤霉病育种效率。