融合蛋白PP13138R及其在结核病预防中的应用的制作方法

本发明属于免疫学领域，涉及融合蛋白pp13138r及其在结核病预防中的应用，具体涉及源自于结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)蛋白抗原的pp13138r重组多表位抗原及其在活动性结核和潜伏性结核感染的预防中的应用。

背景技术：

1、结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteria tuberculosis，mtb)感染引起的一种传染病，通过呼吸道传播。结核分枝杆菌感染分为潜伏性结核病感染(latent tub erculosis infection，ltbi)与活动性结核病(active tuberculosis，atb)两种状态。结核分枝杆菌(mtb)是一种细胞内寄生虫，主要通过攻击巨噬细胞并抑制其凋亡来引起长期感染。

2、疫苗接种是预防和控制结核病最有效的方式。卡介苗(bacillus calmette-guerin，bcg)是唯一获得批准的结核病疫苗，对儿童粟粒性肺结核和结核性脑膜炎具有极好的保护作用。但其对成人结核病的防御效能很差(防御作用0％～80％)，保护期仅维持10～20年，对于有免疫缺陷的病人，bcg接种还有可能导致结核的全身播散。在临床试验中评价的结核病候选疫苗可分为四类：灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位结核病疫苗和基于病毒载体的结核病疫苗。目前，备受期待的亚单位疫苗m72/as01e已完成二期临床试验。然而，2019年《新英格兰医学杂志》(new england journal of medicine)发布了m72/as01e疫苗在2b期临床试验(共纳入3500名10～50岁成人)中的最终数据，表明在3年随访后36个月时，m72/as01e的疫苗总体效力为49.7％(95％ ci 2.1～74.2)，低于who 50％保护效力阈值。因此，新型有效、安全的结核病疫苗的开发更加迫切。

3、随着生物信息学和免疫信息学的快速发展，多肽疫苗已成为最具吸引力的疫苗开发策略之一。通过低成本生产技术，从mtb抗原中鉴定出的肽可以准确地表征为化学实体(类似于经典药物)。此外，多肽是化学定义的化合物，具有良好的稳定性。肽的优良性质奠定了肽疫苗易于运输和保存的优势。此外，由于缺乏冗余元素，可以克服传统疫苗的一些缺点，如过敏和自身免疫反应。作为基于信息学和现代免疫学的交叉学科，免疫信息学的出现导致了疫苗研发模式的改变，推动了新型结核病疫苗领域的研究步伐。利用生物信息学工具，研究人员可以快速、准确地处理免疫研究过程中产生的大量数据，大大缩短了疫苗研发的时间。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种多肽融合蛋白及其在预防结核病中的应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了融合蛋白，命名可为pp13138r，所述融合蛋白可包括串联多肽1、串联多肽2和串联多肽3，所述串联多肽1可包括氨基酸序列是seq idno.1的第105-122位、第128-144位、第150-162位、第168-181位、第187-204位、第210-226位、第232-247位、第253-270位、第276-291位、第297-314位、第320-335位、第341-354位和第360-375位所示的多肽；

3、所述串联多肽2可包括氨基酸序列是seq id no.1的第379-387位、第391-399位、第403-411位、第415-423位、第427-435位、第439-447位、第451-459位、第463-472位、第476-484位、第488-496位、第500-509位、第513-521位和第525-534位所示的多肽；

4、所述串联多肽3可包括氨基酸序列是seq id no.1的第537-556位、第559-578位、第581-600位、第603-622位、第625-644位、第647-666位、第669-688位和第691-710位所示的多肽。

5、进一步地，所述多肽之间可由氨基酸连接子连接。

6、所述串联多肽1可为串联的htl表位，由13个htl表位(氨基酸序列分别为seqidno.1的第105-122位、第128-144位、第150-162位、第168-181位、第187-204位、第210-226位、第232-247位、第253-270位、第276-291位、第297-314位、第320-335位、第341-354位和第360-375位)串联而得，具体地，13个htl表位之间可用氨基酸连接子(如gpgpg)进行串联连接，所述串联多肽1的氨基酸序列具体可为seq id no.1的第105-375位。

7、所述串联多肽2可为串联的ctl表位，由13个ctl表位(氨基酸序列分别为seqidno.1的第379-387位、第391-399位、第403-411位、第415-423位、第427-435位、第439-447位、第451-459位、第463-472位、第476-484位、第488-496位、第500-509位、第513-521位和第525-534位)串联而得，具体地，13个ctl表位之间可用氨基酸连接子(如aay)进行串联连接，所述串联多肽2的氨基酸序列具体可为seq id no.1的第379-534位。

8、所述串联多肽3可为串联的b细胞表位，由8个b细胞表位(氨基酸序列分别为seqid no.1的第537-556位、第559-578位、第581-600位、第603-622位、第625-644位、第647-666位、第669-688位和第691-710位)串联而得，具体地，8个b细胞表位之间可用氨基酸连接子(如kk)进行串联连接，所述串联多肽3的氨基酸序列具体可为seq id no.1的第537-710位。

9、将串联多肽1(串联的htl表位)、串联多肽2(串联的ctl表位)和串联多肽3(串联的b细胞表位)通过氨基酸连接子连接，得到多表位融合蛋白(氨基酸序列可为seq id no.1的第105-710位)，该多表位融合蛋白即可作为活性成分用于构建疫苗分子。

10、进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述串联多肽1、所述串联多肽2和所述串联多肽3。

11、进一步地，所述串联多肽之间可由氨基酸连接子连接。

12、进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述串联多肽1、氨基酸连接子、所述串联多肽2、氨基酸连接子和所述串联多肽3，具体地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述串联多肽1、aay、所述串联多肽2、kk和所述串联多肽3。

13、进一步地，所述融合蛋白还可包括佐剂肽和/或辅助肽，优选地，所述融合蛋白还可包括氨基酸序列是seq id no.1的第1-75位的佐剂肽1、氨基酸序列是seq id no.1的第716-722位的佐剂肽2和/或氨基酸序列是seq id no.1的第81-99位的辅助肽。

14、所述佐剂肽可为tlr-2激动剂porin b(porb)或tlr-4激动剂rs-09，所述辅助肽可为padre。

15、具体地，所述佐剂肽1可为tlr-2激动剂porin b(porb)，所述佐剂肽2可为tlr-4激动剂rs-09(apphals)。

16、所述佐剂肽1(porb)的氨基酸序列可为seq id no.1的第1-75位，所述辅助肽(padre)的氨基酸序列可为seq id no.1的第81-99位，所述佐剂肽2(rs-09)的氨基酸序列可为seq id no.1的第716-722位。

17、进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述佐剂肽1、所述辅助肽、所述串联多肽1、所述串联多肽2、所述串联多肽3和所述佐剂肽2。

18、进一步地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述佐剂肽1、氨基酸连接子、所述辅助肽、氨基酸连接子、所述串联多肽1、氨基酸连接子、所述串联多肽2、氨基酸连接子、所述串联多肽3、氨基酸连接子和所述佐剂肽2。

19、具体地，所述融合蛋白从n端至c端依次可为所述佐剂肽1、eaaak、所述辅助肽、gpgpg、所述串联多肽1、aay、所述串联多肽2、kk、所述串联多肽3、eaaak和所述佐剂肽2。

20、本领域技术人员熟知，氨基酸连接子(也称为间隔子、连接子)是存在于一种融合蛋白中的多肽之间的短肽序列，用连接子连接不同表位的目的是为了防止两个表位连接处形成新的表位，保护天然表位的结构和功能，因此任何能实现这一目的的连接子均可用来连接本发明所述的表位。

21、本文所述氨基酸连接子包括但不限于eaaak、gpgpg、aay、kk、kkk、gggsgg g、ggssgg、gsgsgsg、gsgsg、ggggs和gsg。

22、在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白包括佐剂肽1(porb)、辅助肽padre、13个htl表位、13个ctl表位、8个b细胞表位、佐剂肽2(rs-09)和6×his标签。

23、进一步地，所述融合蛋白pp13138r可为下述任一种：

24、a1)氨基酸序列是seq id no.1的第1-722位的蛋白质；

25、a2)将seq id no.1的第1-722位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

26、a3)在a1)或a2)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质；

27、a4)氨基酸序列是seq id no.1的第105-710位的蛋白质；

28、a5)将seq id no.1的第105-710位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

29、a6)在a4)或a5)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的具有相同功能的融合蛋白质。

30、a1)所述蛋白质可为不包括his标签的融合蛋白(即：所述佐剂肽1-eaaak-所述辅助肽-gpgpg-所述串联多肽1-aay-所述串联多肽2-kk-所述串联多肽3-eaaak和所述佐剂肽2)。

31、a4)所述蛋白质可为多表位融合蛋白(即：所述串联的htl表位-aay-所述串联的ctl表位-kk-所述串联的b细胞表位)。

32、其中，a3)所述融合蛋白质可为在a1)的c端连接his标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

33、进一步地，a3)所述融合蛋白质可为氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质或将seqid no.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与seq idno.1所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

34、本文所述取代可为保守性取代(也称为保守性替换)或非核心功能区的非保守性取代。本领域技术人员所公知，保守性取代或是在非核心功能区进行非保守取代，对蛋白质的功能通常不会产生质的影响。

35、本文所述标签包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、gfp(绿色荧光蛋白)、cfp(青色荧光蛋白)、yfp(黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。

36、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级bl ast2.1中，通过使用blast作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

37、本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

38、本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

39、d1)编码文本中任一所述融合蛋白pp13138r的核酸分子；

40、d2)含有d1)所述核酸分子的表达盒；

41、d3)含有d1)所述核酸分子的重组载体、或含有d2)所述表达盒的重组载体；

42、d4)含有d1所述核酸分子的重组微生物、或含有d2)所述表达盒的重组微生物、或含有d3)所述重组载体的重组微生物；

43、d5)含有d1)所述核酸分子的重组宿主细胞、或含有d2)所述表达盒的重组宿主细胞、或含有d3)所述重组载体的重组宿主细胞。

44、上述生物材料中，d1)所述核酸分子可为下述任一种：

45、b1)编码序列是seq id no.2、seq id no.2的第1-2166位或seq id no.2的第313-2130位的dna分子；

46、b2)核苷酸序列是seq id no.2、seq id no.2的第1-2166位或seq id no.2的第313-2130位的dna分子。

47、进一步地，d2)所述表达盒、d3)所述重组载体、d4)所述重组微生物和d5)所述重组宿主细胞均可表达d1)所述核酸分子。

48、seq id no.2所示的dna分子可为编码氨基酸序列是seq id no.1所示融合蛋白pp13138r的dna分子。

49、seq id no.2的第1-2166位所示的dna分子可为编码氨基酸序列是seq id no.1的第1-722位所示融合蛋白pp13138r的dna分子。

50、seq id no.2的第313-2130位所示的dna分子可为编码氨基酸序列是seq id no.1的第105-710位所示融合蛋白pp13138r的dna分子。

51、所述核酸分子还可包括在seq id no.2、seq id no.2的第1-2166位或seq idno.2的第313-2130位所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

52、本文所述载体是指能够把外源dna或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述载体为载体pet-28a(+)。

53、本文所述微生物可为细菌、真菌、放线菌、原生动物、藻类或病毒。其中，所述细菌可来自埃希氏菌属(escherichia sp.)、欧文氏菌属(erwinia sp.)、土壤杆菌属(agrobacteri um sp.)、黄杆菌属(flavobacterium sp.)、产碱菌属(alcaligenes sp.)、假单胞菌属(ps eudomonas sp.)、芽胞杆菌属(bacillus sp.)等但不限于此，例如所述细菌可为大肠杆菌(escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)或短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)。在本发明的一个或多个实施方案中，所述微生物为大肠杆菌bl21(de3)。

54、本文所述宿主细胞(也称为受体细胞)可为植物细胞或动物细胞。所述宿主细胞可理解为不仅是指特定的受体细胞，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在宿主细胞的范围中。合适的宿主细胞为本领域已知的。

55、本文所述重组载体是指将外源目的基因与载体在体外连接构建而成的重组体dna分子，可以任何合适的方式构建，只要构建的重组载体可携带外源目的基因进入受体细胞、并为外源目的基因提供在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达能力即可。

56、d3)所述重组载体可为pet-28a(+)-pp13138r。

57、重组载体pet-28a(+)-pp13138r是将pet-28a(+)载体的nhei和xhoi识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的dna片段，保持pet-28a(+)载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体。重组载体pet-28a(+)-pp13138r表达氨基酸序列如seq id no.1所示的融合蛋白pp13138r。

58、d4)所述重组微生物可为bl21/pet-28a(+)-pp13138r。所述bl21/pet-28a(+)-pp13138r是将所述重组载体pet-28a(+)-pp13138r导入大肠杆菌bl21(de3)得到的重组微生物。

59、所述导入可为通过化学转化法(如ca2+诱导的转化法、聚乙二醇介导的转化法或金属阳离子介导的转化法)或电穿孔转化法等任何已知的转化方法将携带本发明dna分子的载体转化宿主菌；也可为通过噬菌体转导的方法将本发明dna分子转导进入宿主菌。所述导入还可为通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导法、电穿孔法或病毒载体法等任何已知的转染方法将携带本发明dna分子的载体转染宿主细胞。

60、本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：

61、c1)在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染引起的疾病的产品中的应用；

62、c2)在制备预防结核分枝杆菌感染引起的疾病的疫苗中的应用；

63、c3)在制备针对结核分枝杆菌的保护性抗原中的应用；

64、c4)在筛选和/或开发结核分枝杆菌抗体中的应用。

65、进一步地，所述产品可为试剂或药物。

66、所述保护性抗原是指结核分枝杆菌能刺激机体发生保护性免疫应答的抗原成分。

67、所述结核分枝杆菌抗体可包括全长抗体或抗原结合片段(如fab片段、fv片段、fab′片段、f(ab′)2片段、单链抗体(scfv)、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(mru)等但不限于此)。

68、本发明还提供了用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染引起的疾病的产品，所述产品包括本文中任一所述的融合蛋白。

69、进一步地，所述产品可为疫苗或药物组合物。

70、所述疫苗可用于预防结核分枝杆菌感染。

71、所述疫苗的活性成分可包括本文中任一所述的融合蛋白。

72、所述疫苗还可包括佐剂(adjuvant)和/或疫苗递送系统(vaccine deliverysystem)。

73、所述佐剂可为一种可以刺激机体产生针对与其一同接种的抗原更强烈体液和/或细胞免疫应答的物质。本文所述佐剂可以是本领域技术人员公知的，包括但不限于：植物佐剂(如烷基胺、酚类成分、奎宁、皂角素、倍半萜、蛋白质、多肽、多糖、糖脂、植物血凝素等)、细菌佐剂(如霍乱毒素、大肠埃希菌不耐热毒素、细菌脂多糖等)、铝佐剂及其他无机成分佐剂(如钙佐剂)、细胞因子和核酸佐剂(如单核细胞克隆刺激因子、白细胞因子il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、ifn-γ、cpg基序、核酸载体等)、乳剂佐剂(如弗氏佐剂)。所述佐剂可为药学上可以接受的佐剂。

74、所述疫苗递送系统可为一类能够将抗原物质携带至机体的免疫系统，并在其中较长时间存储和发挥其抗原作用的物质。本文所述疫苗递送系统可为吕盐凝胶佐剂疫苗递送系统、乳剂佐剂疫苗递送系统、脂质体佐剂疫苗递送系统或纳米佐剂疫苗递送系统。

75、所述药物组合物的活性成分可包括本文中任一所述融合蛋白。

76、所述药物组合物还可包括一种或者是多种药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。

77、进一步地，本文所述结核分枝杆菌感染引起的疾病可为结核病。

78、进一步地，所述结核病可包括活动性结核病(active tuberculosis，atb)和潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection，ltbi)。

79、本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法可包括使编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子在微生物或宿主细胞中进行表达得到所述融合蛋白。

80、进一步地，所述方法可包括如下步骤：

81、g1)构建含有编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子的重组表达载体；

82、g2)将所述重组表达载体导入微生物，得到重组微生物；

83、g3)培养所述重组微生物，经分离和/或纯化得到所述融合蛋白；

84、进一步地，g1)中所述核酸分子可为seq id no.2、seq id no.2的第1-2166位或seq id no.2的第313-2130位所示的dna分子。

85、进一步地，所述微生物可为大肠杆菌bl21(de3)。

86、本发明的发明人通过生物信息学和免疫信息学技术预测和筛选出了针对结核分枝杆菌的htl、ctl和b细胞表位，这些表位具有很好的免疫原性和抗原性且无毒性无致敏性，具有人口覆盖率高等特点。在此基础上，发明人在表位疫苗设计中加入了tlr2激动剂porb、tl r-4激动剂rs-09(apphals)和辅助肽padre来进一步提高表位疫苗分子的免疫原性。进一步通过免疫信息学工具对该疫苗的抗原性、免疫原性、理化参数、二级结构、三级结构、免疫刺激等进行了预测和分析。结果表明，本发明所提供的多肽融合蛋白pp13138r的抗原性为0.8968，免疫原性为1.44921，溶解度指数为0.515。二级结构预测显示，pp13138r的α-螺旋占45.88％，β-股占10.30％，螺旋占43.82％。三级结构分析显示pp13138r的z-score和favor区分别为-3.5和72.6％。pp13138r与tlr2的结合能为-1167.3，pp13138与tlr4的结合能力为-1255.1rkcal/mol。

87、本发明进一步制备了融合蛋白pp13138r，通过酶联免疫斑点试验(elispot)和th1/th2/th17细胞因子检测实验分析免疫信息学和真实世界实验结果的一致性，免疫信息学和真实世界实验结果均表明，多肽融合蛋白pp13138r可诱导机体产生以ifn-γ、tnf-α、il-4和il-10等细胞因子水平显著升高为特征的固有免疫和适应性免疫应答。同时体外实验结果证明了结核分枝杆菌的多肽融合蛋白pp13138r可以作为一种抗原蛋白，能够刺激人外周血单个核细胞(pbmcs)产生免疫应答，是一种优势保护性抗原，本发明可为结核病疫苗的开发提供新的候选疫苗。

88、本发明多肽融合蛋白pp13138r可通过基因工程制备，用多肽融合蛋白pp13138r作为疫苗，与菌体蛋白疫苗相比，具有制备方法简单、成本低、产量高、更安全等优点。本发明对于活动性结核和结核潜伏感染的防疫和治疗具有重大价值。