一种CRP驼源单域抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药领域，具体讲是一种crp驼源单域抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、免疫球蛋白（immunoglobulin，ig），一种具有抗体活性或者化学结构和抗体分子相似的球蛋白。抗血清能与相关抗原免疫结合，根本原因为抗血清中存在免疫球蛋白，它是免疫细胞的产物（单克隆抗体除外），另外，此物质也分布在机体的体液、外分泌液和淋巴细胞的膜上。免疫球蛋白有多种成分，主要是igg，占总体的70%左右，约为7-16g/l。哺乳动物的ig分子呈对称型结构，都是由4条肽链组成，肽链间以二硫键链接。如图1所示，其中重链（heavy chain，h链）为两条长链，轻链（light chain，l链）为两条短链，链间二硫键将4条链构成经典的y型。无论是重链或轻链，第一个结构域的氨基酸序列均具有多样性，称为免疫球蛋白分子识别抗原的可变区(variable region)。可变区之后是序列相对固定的区域，称为恒定区(constsant region)，除铰链区外，每个结构域约由 110 个氨基酸残基组成并都有其独特的功能。免疫球蛋白的可变区包括四个为结构域提供骨架结构，维持空间结构的稳定的骨架区（framework region,fr）和介于它们之间的三个与抗原表面形成互补关系的互补决定区(complementary determining region, cdr)。cdr 区的氨基酸序列差异性非常大，又被称为高变区（hypervariable regions）。与可变区相比，恒定区序列在种内较为保守vh和vl内各有4个骨架区，分别以fr1、fr2、fr3和fr4表示。

2、1993 年， hammers 等人在骆驼外周血淋巴细胞中分离出一种结构不同于传统抗体的重链抗体，该抗体天然缺失轻链还有重链可变区 ch1，通过将此抗体的可变区进行pcr扩增，即可得到一抗体片段，称单域抗体。此单域抗体的分子量仅有约15 kda，传统常规抗体分子量一般为 155 kda左右，因单域抗体分子量只有其分子量的 1/10 左右，故又称单域抗体为纳米抗体（ vhh, variable domain of heavy chain of heavy 2chainantibody）。即使该抗体仅含有重链，但是其仍具有完整的抗原结合性能。vhh 抗体不但具有完整的抗原亲和性，同时还具有诸多的优点，例如 vhh 抗体cdr3 区有一个暴露地大凸环（由二硫键保持稳定），可深入到抗原的裂隙或空腔中，使 vhh 抗体与抗原结合能力增强，该抗体具备分子量小、容易获得和表达、高水溶性和稳定性、靶向性和人源性简单等优点。vhh抗体作为研究工具载体、疾病诊断工具和疾病治疗策略等方面具有很好的应用前景。

3、c-反应蛋白（crp）是机体在炎症、感染或损伤时产生的一种急性期反应蛋白，当其升高时提示机体发生炎症反应。人crp 发挥重要的功能，例如参与宿主防御、抗原清除和代谢等，都需要通过其与一系列外生或自体因子的相互作用。c反应蛋白可以与 dna 和组蛋白相互作用，它可以清除受损循环细胞释放的核物质。除以上功能和效应外，crp同时还具有致病效应。例如crp 浓度的升高被证明与冠状动脉粥样硬化疾病密切相关。crp 不仅是动脉粥样硬化疾病的标志物，更可能直接参与其形成，crp 与氧化的 ldl（低密度脂蛋白）结合加剧冠状动脉梗塞中的组织损伤，并抑制受损血管内皮的修复。

技术实现思路

1、本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种crp驼源单域抗体及其制备方法和应用。

2、本发明的技术解决方案如下：

3、一种crp驼源单域抗体，包括框架区和可变区，所述可变区具有第一可变区、第二可变区以及第三可变区；所述第一可变区为氨基酸序列seq id no:2上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为氨基酸序列seq id no:2上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为氨基酸序列seq id no:2上的第97-106位氨基酸区域。

4、本发明还公开了一种crp驼源单域抗体的制备方法，通过免疫crp抗原的羊驼白细胞进行富集，然后进行单细胞筛选、测序。通过测序结构分析，构建驼源crp抗体重组质粒，克隆转化真核细胞中表达相关抗体，筛选得到具有人crp抗性的单抗，对所述单抗的vhh结构域进行克隆表达，通过配对筛选得到。

5、本发明还公开了一种elisa试剂盒，包含如上所述的crp驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的crp驼源单域抗体。

6、本发明还公开了一种化学发光试剂盒，包含上所述的crp驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的crp驼源单域抗体。

7、本发明还公开了一种胶乳试剂盒，包含如上所述的crp驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的crp驼源单域抗体。

8、本发明还公开了如上所述的crp驼源单域抗体或如上所述的制备方法制得的crp驼源单域抗体在制备抗肿瘤药物上的应用。

9、本发明的有益效果是：本发明通过免疫crp抗原的羊驼白细胞进行富集，然后进行单细胞筛选、测序。通过测序结构分析，构建驼源crp抗体重组质粒，克隆转化真核细胞中表达相关抗体，筛选得到具有人crp抗性的单抗，对所述单抗的vhh结构域进行克隆表达，通过配对筛选得到具有抗体活性的crp-vhh的单抗。该抗体能够应用在elisa试剂盒、化学发光试剂盒、胶乳试剂盒，且具有和现有的相关试剂盒进行检测具有同标准功能，同时该抗体仍具有在制备抗肿瘤药物上的用途。

技术特征：

1.一种crp驼源单域抗体，其特征在于，包括框架区和可变区，所述可变区具有第一可变区、第二可变区以及第三可变区；所述第一可变区为氨基酸序列seq id no:2上的第28-34位氨基酸区域，第二可变区为氨基酸序列seq id no:2上的第52-58位氨基酸区域，第三可变区为氨基酸序列seq id no:2上的第97-106位氨基酸区域。

2.一种elisa试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的crp驼源单域抗体。

3.一种化学发光试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的crp驼源单域抗体。

4.一种胶乳试剂盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的crp驼源单域抗体。

技术总结
本发明公开了一种CRP驼源单域抗体及其制备方法和应用，涉及生物医药领域，通过免疫CRP抗原的羊驼白细胞进行富集，然后进行单细胞筛选、测序。通过测序结构分析，构建驼源CRP抗体重组质粒，克隆转化真核细胞中表达相关抗体，筛选得到具有人CRP抗性的单抗，对所述单抗的VHH结构域进行克隆表达，通过配对筛选得到具有抗体活性的CRP‑VHH的单抗。该抗体能够应用在ELISA试剂盒、化学发光试剂盒、胶乳试剂盒，且具有和现有的试剂盒同等功能，同时该抗体仍具有在制备抗肿瘤药物上的用途。

技术研发人员：郝立颖,彭勇,韩豪杰,彭悦蕾,曹培杰
受保护的技术使用者：北京世纪沃德生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15