一种源于植物乳杆菌的新型抗菌蛋白LP1Z_01335及其应用

本发明属于生物医药领域，具体涉及种源于植物乳杆菌的新型抗菌蛋白(lp1z_01335)及其应用。

背景技术：

1、幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori，hp)是革兰氏阴性菌，其感染是导致人类胃肠道疾病的关键因素之一，因此，预防和治疗幽门螺旋杆菌感染是防止胃炎、胃溃疡甚至胃癌发生的有效策略，也是消化内科医生和学者们的研究热点。目前，国内根除hp主要采用抗生素联用质子泵抑制剂、铋剂治疗，与此同时抗生素耐药性也逐年递增，我国幽门螺旋杆菌抗生素耐药率总体上很高，尤其是东南沿海城市高达95.4％。因此，寻找一种能够拮抗hp的非抗生素类物质，用于医学领域中因hp感染引起的慢性炎症治疗就显得十分迫切。

2、在之前的研究中，中国广东省梅州市健康百岁老人的粪便作为样本，分离得到一株植物乳杆菌lp1z，该益生菌具有高效拮抗hp甚至多药耐药hp的作用。通过比较基因组学的方法，发现了该植物乳杆菌的一段特异性功能基因，这段基因被注释为胞壁水解酶假定蛋白，含有lysm结构域、prk13914结构域、prk06347结构域。lysm是一种广泛分布的蛋白质基序，其功能主要与肽聚糖和几丁质的结合有关，最有可能识别n-乙酰葡糖胺部分。最初发现其存在于降解细菌细胞壁的酶中，且大多数含lysm的细菌蛋白是肽聚糖水解酶，但涉及许多其他生物学功能的蛋白质也含有该结构域。prk13914功能域可能与侵袭相关内肽酶的功能相关。prk06347功能域可能与1，4-β-n-乙酰胞壁氨酰水解酶的功能相关。该假定蛋白是胞外蛋白，经预测具有肽聚糖结合、抗菌及1，4-β-n-乙酰胞壁氨酰水解酶的相关功能，因此，推测该假定蛋白为一种抗菌蛋白。肽聚糖存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁中，所以推测该抗菌蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有消杀作用，在下文的实施例中也证实了该抗菌蛋白的抑菌效果。

3、目前，数据库中并未将该抗菌蛋白进行功能上的归类，仅定义为lysm功能域包含蛋白。同时，也未见该蛋白抗菌、抗幽门螺旋杆菌甚至抗多药耐药hp方面的报道。lp1z_01335是来自益生微生物的抗菌蛋白，对人类具有较高的使用安全性，所以，挖掘该蛋白高效拮抗多药耐药hp的新功能，明确其耐受高温、低ph且酶稳定性高的优良性能，并通过多次实验确定培养、诱导、纯化的最佳条件以使获得的蛋白产量最大化和纯度最高化是本领域学者亟待解决的技术问题。同时，对该抗菌蛋白的抗幽机制、理化性质和制备方法进行归纳总结也显得尤为重要。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种抗菌蛋白，该酶来源于植物乳杆菌，具有较高抗多药耐药hp的活性。

2、本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：

3、第一个目的在于本发明提供了一种抗菌蛋白lp1z_01335，所述抗菌蛋白来自植物乳杆菌，其氨基酸序列如seq id no.1所示，由352个氨基酸组成；或如seq id no.4所示。

4、本发明的第二个目的在于提供上述抗菌蛋白lp1z_01335的编码基因。

5、优选地，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，或如密码子优化后的序列seq id no.3所示。

6、本发明的第三个目的在于提供抗菌蛋白lp1z_01335在如下任一种中的应用：

7、a.在制备抗菌药物、预防或/和治疗幽门螺旋杆菌感染药物、或治疗胃肠道疾病药物中的应用；

8、b.在制备抗菌剂或消毒剂中的应用；

9、c.在制备食品或饲料添加剂中的应用；

10、d.在食品或饲料加工中的应用；

11、e.在制备医学或生物样品运输中保护剂或添加剂中的应用；

12、f.在制备医疗产品中的应用；

13、g.在医疗器械清洁中的应用；

14、h.在制备化妆品或洗漱用品中的应用；

15、i.在制备洁厕剂或除臭剂中的应用。

16、优选地，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或幽门螺旋杆菌的药物。

17、本发明的第四个目的在于提供一种重组载体，所述载体含有上述抗菌蛋白lp1z_01335的编码基因。

18、优选地，含有seq id no.3所示的核苷酸序列。

19、本发明的第五个目的在于提供一种重组工程菌，所述重组工程菌含有上述重组载体。

20、本发明的第六个目的在于提供制备上述抗菌蛋白lp1z_01335的方法，其特征在于，将上述的编码基因或重组载体在微生物中进行表达并制备抗菌蛋白。

21、优选地，所述的微生物为大肠杆菌。

22、本发明的第七个目的在于提供一种酶制剂，其包含上述抗菌蛋白lp1z_01335作为活性成分。

23、优选地，所述的酶制剂为拮抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌或多药耐药幽门螺旋杆菌的酶制剂。该酶制剂不仅能拮抗金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，还能在胃部等酸性环境中拮抗幽门螺旋杆菌(g-)甚至多药耐药幽门螺旋杆菌，具有较好的酶稳定性。

24、本发明的有益效果为：

25、本发明的抗菌蛋白具有良好的ph、高温耐受性和酶稳定性。本发明的抗菌蛋白制剂在ph 3.0～9.0的范围内抑菌活性能保留88.3％及以上，能够在胃部等极端环境下更好地发挥抗幽门螺旋杆菌甚至多药耐药幽门螺旋杆菌的作用。在37℃～100℃范围内抑菌活性能保留99.6％，能适应更多工业化生产的工艺条件。分别经过胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后，抑菌活性能保留60.9％、88.1％、99.9％，表明本发明的抗菌蛋白性质稳定。

26、更宽的ph、高温耐受性和酶稳定性，使lp1z_01335具有较同类型酶制剂更优良的酶学性质，能适应更多的应用场景，不仅仅局限于体外的抗菌消毒，在体内的药物、食品、保健品等应用中也具有很大潜力。

27、与传统抗幽门螺旋杆菌的抗生素类药物相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全的优势。在传统异源表达与纯化制备方法的基础上，对重组表达载体合成、培养条件、诱导表达方法、纯化方法等进行优化，通过多次实验确定最优制备方法，以期获得的重组抗菌蛋白产量和纯度最好。

28、植物乳杆菌lactiplantibacillus plantarum lp1z保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：62256，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏日期为：2022年2月21日。

技术特征：

1.一种抗菌蛋白lp1z_01335，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.1或seq id no.4所示。

2.编码权利要求1所述的抗菌蛋白lp1z_01335的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.2或seq idno.3所示。

4.权利要求1所述的抗菌蛋白lp1z_01335在如下任一种中的应用：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或幽门螺旋杆菌的药物。

6.一种含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体。

7.一种含有权利要求6所述的重组载体的重组工程菌。

8.一种制备权利要求1所述的抗菌蛋白lp1z_01335的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的编码基因或权利要求6所述的重组载体在微生物中进行表达并制备抗菌蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的微生物为大肠杆菌。

10.一种酶制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的抗菌蛋白lp1z_01335作为活性成分。

技术总结
本发明公开了一种源于植物乳杆菌的新型抗菌蛋白LP1Z_01335及其应用。所述抗菌蛋白LP1Z_01335的氨基酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或密码子优化后的SEQ ID NO.3所示。抗菌蛋白LP1Z_01335能拮抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌及多药耐药幽门螺旋杆菌。与传统抗幽门螺旋杆菌的抗生素类药物相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全的优势。本发明的抗菌蛋白制剂具有更宽的pH、高温耐受性和酶稳定性，能适应更多的应用场景，在体外的抗菌消毒、体内的药物、食品、保健品等应用中具有很大潜力。

技术研发人员：吴清平,商燕燕,李滢,谢新强,陈玲,吴诗,古其会,叶青华,张菊梅,杨宁,陈惠元
受保护的技术使用者：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15