生产苯基丙酸及其衍生物的重组菌、其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种生产苯基丙酸及其衍生物的重组菌、其构建方法和应用。

背景技术：

1、苯基丙酸(即3-苯丙酸)的中文别名为氢化肉桂酸。氢化肉桂酸是香料的定香剂，可以用作医药中间体，也用于有机合成，还可以用于烘烤食品、布丁、冰冻乳制品等。

2、3,4-二羟基苯基丙酸是苯基丙酸的衍生物，又名二氢咖啡酸，存在于丹参、白术、杜仲等体内，具有较强的抗氧化活性，广泛应用于医药行业，具有潜在治疗抑郁症的作用。

3、苯基丙酸及其衍生物的制备方法主要有提取法、化学合成法。提取法及化学合成法的高成本、低产率、低纯度限制了其工业化应用。现有的苯基丙酸及其衍生物的生物合成路线具有产量低、生产效率低、底物成本高等缺点，不利于工业化生产。

4、因此，创建一条产量高、效率高、成本低的苯基丙酸及其衍生物的制备方法迫在眉睫。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种生产苯基丙酸及其衍生物的重组菌及其构建方法和应用，利用该重组菌生产苯基丙酸及其衍生物，产物产量高，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。

2、本发明为了改善苯基丙酸及其衍生物在现有技术中存在的产量低、生产效率低、底物成本高等缺陷，提供了新的合成路线。

3、对于苯基丙酸的合成：

4、通过l-赖氨酸2,3-氨基变位酶(amu)将l-苯丙氨酸及其衍生物转化为3-氨基-3-苯基-丙酸，通过天冬氨酸氨裂解酶(aspa)将3-氨基-3-苯基-丙酸转化为3-苯基-丙烯酸，通过富马酸还原酶(fr)将3-苯基-丙烯酸转化为苯基丙酸，反应过程中所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供，反应原理如图2所示。

5、对于二氢咖啡酸的合成：

6、通过l-赖氨酸2,3-氨基变位酶(amu)将左旋多巴转化为3-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酸，通过天冬氨酸氨裂解酶(aspa)将3-氨基-3-(3,4-二羟基苯基)-丙酸转化为咖啡酸，通过富马酸还原酶(fr)将咖啡酸转化为3,4-二羟基苯基丙酸，反应过程中所需辅酶由菌体代谢葡萄糖来提供，反应原理如图2所示。

7、基于上述合成路线，本发明提供了一种生产苯基丙酸及其衍生物的重组菌，该重组菌中共表达l-赖氨酸2,3-氨基变位酶、天冬氨酸氨裂解酶及富马酸还原酶。

8、根据上述反应原理，发明人将编码l-赖氨酸2,3-氨基变位酶、天冬氨酸氨裂解酶及富马酸还原酶的基因导入宿主菌中，获得一种重组菌，以该重组菌作为生物催化剂，可将底物l-苯丙氨酸及其衍生物转化为苯基丙酸及其衍生物。

9、在一些优选的方式中，l-苯丙氨酸的衍生物为l-苯丙氨酸的苯环上连接至少一个取代基，所述取代基可以为羟基、烷基、杂烷基、酰基、羧基、醛基、氨基等。

10、在一些优选的方式中，l-苯丙氨酸的衍生物可以是l-3,4-二羟基苯丙氨酸、l-4-羟基苯丙氨酸、l-3-羟基苯丙氨酸、l-3,4-二氨基苯丙氨酸、l-3,4-二羧基苯丙氨酸等。

11、在一些实施方式中，l-赖氨酸2,3-氨基变位酶包括csamu和asamu，csamu的氨基酸序列如seq id no.1所示；asamu的氨基酸序列如seq id no.2所示。

12、在本发明中，csamu来源于clostridium subterminale，genbank编号为aad43134.1；asamu来源于acetoanaerobium sticklandii，genbank编号cbh21502.1。发明人在获得l-赖氨酸2,3-氨基变位酶csamu和asamu的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。

13、在一些实施方式中，csamu的核苷酸序列如seq id no.3所示；asamu的核苷酸序列如seq id no.4所示。

14、在一些实施方式中，天冬氨酸氨裂解酶包括smaspa和ffaspa，smaspa的氨基酸序列如seq id no.5所示；ffaspa的氨基酸序列如seq id no.6所示。

15、在本发明中，smaspa来源于serratia marcescens，genbank编号baa02518.1；ffaspa来源于flavobacterium frigidimaris，genbank编号bac11912.1。发明人在获得天冬氨酸氨裂解酶smaspa和ffaspa的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。

16、在一些实施方式中，smaspa的核苷酸序列如seq id no.7所示；ffaspa的核苷酸序列如seq id no.8所示。

17、在一些实施方式中，富马酸还原酶包括lpfr及effr，lpfr的氨基酸序列如seq idno.9所示；effr的氨基酸序列如seq id no.10所示。

18、在本发明中，lpfr来源于lactococcus piscium，genbank编号spc35538.1；effr来源于enterococcus faecium，genbank编号aom37593.1。发明人在获得富马酸还原酶lpfr和effr的氨基酸序列后，依据大肠杆菌偏好性进行密码子优化，以全合成的方法合成两条优化后的核苷酸序列。

19、在一些实施方式中，lpfr的核苷酸序列如seq id no.11所示；effr的核苷酸序列如seq id no.12所示。

20、在一些实施方式中，上述重组菌的宿主为大肠杆菌。

21、在一些实施方式中，上述大肠杆菌选自escherichia coli bl21、escherichiacoli dh5α和escherichia coli xl-blue中的任意一种。

22、在一些实施方式中，重组菌含有表达载体，表达载体包括pet28a(+)质粒和pacycduet-1质粒。

23、第二方面，本发明还提供了上述重组菌的构建方法，其包括：将l-赖氨酸2,3-氨基变位酶、天冬氨酸氨裂解酶及富马酸还原酶的基因连接到表达载体上，然后将获得的重组表达载体导入至宿主菌中，即获得重组菌。

24、在本发明中，在上述l-赖氨酸2,3-氨基变位酶、天冬氨酸氨裂解酶及富马酸还原酶中各选一个酶，进行三酶组合共表达，对于导入携带上述酶的编码基因的质粒的方式，可以是其中任意两个编码基因存在于同一质粒上，还可以是三种基因分别存在于不同的质粒上，也可以是其他导入方式，对此本发明不做限定。

25、较为优选地，pet28a(+)和pacycduet-1双质粒共表达3个酶的编码基因；pet28a(+)装载l-赖氨酸2,3-氨基变位酶，pacycduet-1装载天冬氨酸氨裂解酶及富马酸还原酶。

26、第三方面，本发明提供了一种生产苯基丙酸及其衍生物的方法，其包括将上述重组菌加入含有底物l-苯丙氨酸及其衍生物的转化体系中进行全细胞转化，获得苯基丙酸及其衍生物。

27、在一些实施方式中，转化体系包括l-苯丙氨酸及其衍生物1-30g/l，葡萄糖5-50g/l。

28、在一些实施方式中，重组菌在转化体系中的新鲜菌体量为1-20g/l。

29、在一些实施方式中，转化体系的ph为6.0-9.0。

30、在一些实施方式中，转化体系的转化温度为15-40℃。

31、在一些实施方式中，转化体系的转化时间为10-24h。

32、第四方面，本发明还提供了一种全细胞催化剂，其含有上述重组菌。利用上述全细胞催化剂能够将底物转化为目标产物。

33、第五方面，本发明还提供了上述重组菌在化妆品、食品和医药领域中的应用。

34、进一步地，上述重组菌在制备化妆品、食品和药品原料中的应用。

35、本发明具有以下有益效果：

36、本发明提供了一种新的生产苯基丙酸及其衍生物的方法，利用一种大肠杆菌重组菌以l-苯丙氨酸及其衍生物为底物生产苯基丙酸及其衍生物。

37、重组菌产生的l-赖氨酸2,3-氨基变位酶、天冬氨酸氨裂解酶、富马酸还原酶的活性较高，能够将l-苯丙氨酸及其衍生物高效地转化为苯丙烯酸及其衍生物，进一步地将其转化为苯基丙酸及其衍生物。

38、l-苯丙氨酸及其衍生物(比如左旋多巴)来源广、制备过程简单且价格低廉，是理想的底物，本发明选择的酶具有活性高、光学专一性强等优势，因此，利用本发明的重组菌转化生产苯基丙酸及其衍生物，生产效率高、绿色环保且成本低，具有良好的工业化应用前景。