Prdx1IgG中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用

本发明属于医药领域，具体涉及prdx1 igg中和抗体及其制备方法和在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用。

背景技术：

1、急性肝损伤(acute liver injury，以下简称ali)是由各种原因引起的肝脏损害，其病情发展迅速。研究表明，外源性物质，如病毒感染、滥用酒精或药物以及接触毒素都可能导致ali。在我国急性肝损伤的首要病因是病毒感染，其次是药物。由于ali所引起的坏死后型肝硬化不能治愈，不仅严重影响患者的生活质量，同时也给国家带来了沉重的医疗负担。因此预防急性肝损伤对公共卫生非常重要。对于严重ali，肝移植是最有效的治疗手段之一，但统计表明接受肝移植治疗的患者不足10％。当前国内外对急性肝衰竭的治疗十分有限，病死率非常高。因此，寻找ali的替代疗法是一项迫切的医疗需求。全球范围内已经开展了大量研究工作以寻找有效的防治ali的药物，部分在临床使用较长时间，但目前这些药物的治疗效果依然差强人意。

2、急性肾损伤(acute kidney injury，aki)是一种临床常见的综合征，它的发生常伴随着患者住院时间延长，部分患者预后不良进一步发展为慢性肾脏病。全球每年约1300万人发生aki，约170万人死于aki及其并发症。aki可发生于临床多个学科，特别是在icu中发病率超过50％。在我国，一项大样本多中心流行病学调查数据显示，按照kdigo aki的诊断标准和扩展标准，aki发生率为0.99％和2.03％，而住院病死率高达12.4％。近年来，aki的患病率均呈上升趋势，且病死率居高不下，给国家和社会造成了巨大的经济负担。长期以来临床对于aki始终沿袭对症支持的治疗原则，静待肾脏病变自身的转归，迄今为止尚无一种可以用于在aki中减轻肾组织损伤或促进肾脏修复或防止后期肾脏慢性纤维化的治疗药物获批上市。

3、脓毒症是指因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房患者死亡的主要原因之一。国内最新的icu流行病学横断面调查报告显示，icu脓毒症发病率为23.9％，90d病死率为35.5％。高死亡率的背后是其治疗手段匮乏、疗效不佳的现状。因此，开发一种新的药物治疗脓毒症，是一项迫切的医疗需求。

4、急性肺损伤是由各种肺内外病因引起的肺部损伤，其严重形式表现为急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome，ards)，患者常出现顽固的低氧血症和呼吸衰竭，是危重症患者出现不良预后的重要原因之一。急性肺损伤的主要病因或诱因包括肺炎、非肺源性脓毒症、胃内容物误吸等。在全球范围内，每年急性肺损伤患病总人数达300万。在icu患者中急性肺损伤的患病率可达10％，而在需要机械通气的患者中，其患病率达到23％。急性肺损伤的总体死亡率达40％以上，且病情越重患者死亡率越高。急性肺损伤的治疗主要是控制原发疾病以及对症支持治疗。机械通气是其治疗基石，但呼吸机诱导的肺损伤(ventilator-induced lung injury，vili)在临床上时有发生。目前尚无有效的药物用于治疗急性肺损伤，虽然已有多项针对急性肺损伤治疗药物的研究，包括β2激动剂、角化细胞生长因子(keratinocyte growth factor，kgf)以及他汀类药物等，这些药物在病理生理学和临床前研究中取得了强有力的证据，但均未在临床应用中获得明确疗效。因此开发有效的治疗药物仍十分迫切。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供prdx1 igg中和抗体及其在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用，用以解决目前医药领域对于急性肝损伤、急性肾损伤、脓毒症治疗药物的缺失的技术问题。

2、为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

3、一种prdx1 igg中和抗体，该中和抗体是一类可与prdx1蛋白特异性结合的igg抗体，包括抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体或抗prdx1蛋白的多克隆中和抗体。

4、上述的prdx1 igg中和抗体，优选的，所述抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体的氨基酸序列包含seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq idno.6中任一个氨基酸序列或多个氨基酸序列的组合，或者包含seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6中任一个或多个氨基酸序列中的氨基酸经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰得到的具有80％以上同源性的氨基酸序列。

5、优选的，所述抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体的重链可变区的cdr1区域氨基酸序列如seq id no.1所示，其重链可变区的cdr2区域氨基酸序列如seq id no.2所示，其重链可变区的cdr3区域氨基酸序列如seq id no.3所示；所述抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体的轻链可变区的cdr1区域氨基酸序列如seq id no.4所示，其轻链可变区的cdr2区域氨基酸序列如seq id no.5所示；其轻链可变区的cdr3区域氨基酸序列如seq id no.6所示。

6、优选的，所述抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体包括重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸，其中重链可变区氨基酸序列如seq id no.7所示，轻链可变区氨基酸序列如seq idno.8所示。

7、上述的prdx1 igg中和抗体，优选的，所述抗prdx1蛋白的多克隆中和抗体由以下方法制备得到：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达prdx1 igg中和抗体的哺乳动物，最后从哺乳动物血清中提取和纯化得到抗prdx1蛋白的多克隆中和抗体。

8、上述的prdx1 igg中和抗体，优选的，所述prdx1 igg中和抗体包括兔来源、人来源、小鼠来源、大鼠来源或人鼠嵌合的prdx1中和抗体。

9、编码上述prdx1 igg中和抗体的核酸分子，包括编码所述prdx1 igg中和抗体重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸，其中编码重链可变区的核苷酸序列如seq id no.9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.10所示。

10、peroxiredoxin1(prdx1，prx1)是一种抗氧化蛋白，属于peroxiredoxins(prdxs)超家族。prdx1是该家族中表达最为广谱、表达丰度最高的成员，被认为是体内最重要的抗氧化酶之一。经过前期的研究发现：prdx1的中和抗体具有对于急性肝、肾损伤的潜在治疗作用。有望成为一种治疗急性肝、肾损伤的新药，用以解决目前医药领域对于急性肝损伤和急性肾损伤治疗药物的缺失的技术问题。

11、基于一个总的发明构思，还提供一种prdx1 igg中和抗体的制备方法，所述prdx1igg中和抗体为抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体，包括以下步骤：

12、a)以哺乳动物离体肿瘤细胞的cdna为模板进行pcr扩增，得到目的基因片段prdx1连接至载体质粒中，转化大肠杆菌，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确的哺乳动物prdx1基因序列的原核表达质粒；

13、b)将所述原核表达质粒转化于表达宿主菌进行培养，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为哺乳动物源prdx1蛋白；

14、c)将纯化后得到的哺乳动物源prdx1蛋白作为抗原，对免疫动物进行免疫；

15、d)免疫结束后取免疫动物的组织，提取浆细胞与骨髓瘤细胞融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养后，以所述人源prdx1抗原包被，elisa筛选阳性克隆，以有限稀释法进行亚克隆，获得杂交瘤细胞；

16、e)将所述杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔以制备腹水，将腹水进行分离、纯化，得到抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体。

17、上述的制备方法，优选的，具体包括以下步骤：

18、a)以人肿瘤细胞u87mg的cdna为模板进行pcr扩增，pcr扩增采用的引物如下：

19、prdx1-f：ctgccaagtgattggtgcttctg；

20、prdx1-r：aatggtgcgcttcgggtctgat；

21、获得两端带有酶切位点ecori/xhoi的prdx1基因片段，用ecori/xhoi双酶切得到目的基因片段prdx1；将载体质粒pet22b用ecori/xhoi双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收载体片段，与所述目的基因片段prdx1在t4连接酶作用下连接，然后转化大肠杆菌top10，经氨苄青霉素抗性筛选、ecori/xhoi酶切鉴定，筛选含插入片段的阳性克隆并通过测序验证，得到含有正确的哺乳动物prdx1基因序列的原核表达质粒pet22b-prdx1；

22、b)将所述原核表达质粒转化于表达宿主菌bl21，并平铺于含氨苄青霉素抗性的平皿上倒置培养过夜，挑取单克隆进行诱导表达得到菌液，纯化得到目的表达蛋白，即为人源prdx1蛋白；

23、c)将纯化后得到的人源prdx1蛋白作为抗原与完全弗氏佐剂充分乳化混合皮下免疫6-8周龄小鼠，4周后采用人源prdx1蛋白与不完全弗氏佐剂乳化混合，腹腔注射免疫小鼠，其后间隔2周继续腹腔抗原加强免疫，在第4次加强免疫1周后，以所述的人源prdx1蛋白进行包被，通过elisa法检测小鼠抗血清效价，继续加强免疫，直至小鼠的抗血清效价达到>105，最后一次加强免疫3周后，脾内免疫所述哺乳动物源prdx1蛋白，备用；

24、d)小鼠经脾内加强免疫后4天，在无菌情况下取脾，分离去除淋巴细胞得到浆细胞，与骨髓瘤细胞系sp2/0融合，经次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养3天后，补加ht培养基，继续培养1周；以所述人源prdx1抗原包被，elisa筛选阳性克隆，以有限稀释法进行3次亚克隆，继续连续培养2个月，最后获得稳定杂交瘤细胞系；

25、e)取杂交瘤细胞，以5×105细胞/小鼠的量注射小鼠腹腔以制备腹水，取腹水用乙酸钠缓冲液稀释，滴入辛酸，离心弃去沉淀，上清液以磷酸缓冲液透析过夜，取出透析液，加入饱和硫铵静置，离心弃上清液，用pbs溶解，透析，将透析溶液离心弃去沉淀，收集上清液；取蛋白g亲和柱回复室温，用pbs平衡5个柱体积，将最后收集的上清液上柱，用pbs洗5个柱体积，以甘氨酸盐酸溶液洗脱，洗脱液加入磷酸氢二钠溶液中和，将溶液用pbs透析，将透析溶液离心，上清液通过0.22μm滤膜过滤保存，得到纯化的抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体。

26、基于一个总的发明构思，还提供一种prdx1 igg中和抗体的制备方法，所述prdx1igg中和抗体为抗prdx1蛋白的多克隆中和抗体，包括以下步骤：采用重组prdx1蛋白作为免疫原，免疫哺乳动物，获得表达prdx1 igg中和抗体的哺乳动物，最后制备和纯化抗prdx1蛋白的多克隆中和抗体。

27、上述的制备方法，优选的，具体包括以下步骤：

28、(1)选取兔作为免疫动物，在制备中和抗体之前进行血清采集；

29、(2)于第1天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.4-0.6mg，并予以完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫原；

30、(3)于第14天、第35天、第56天采用免疫原，即重组prdx1蛋白0.2-0.3mg，并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行皮下注射免疫；

31、(4)于第63天，采集步骤(3)处理后的兔血液，提取血清，使用血清进行elisa检测是否存在prdx1 igg中和抗体；

32、(5)挑选出血清中表达prdx1 igg中和抗体的兔子，于第70天再次使用0.2-0.3mg免疫原并予以不完全弗氏佐剂对免疫动物进行加免；

33、(6)采集步骤(5)处理后的兔子血清，采用抗原亲和柱纯化抗体，即得到所述的prdx1igg中和抗体；并使用elisa法检测其与prdx1重组蛋白的亲和力；使用western blot法检测prdx1 igg中和抗体的特异性。

34、本发明首次发现prdx1蛋白是治疗急性器官损伤及脓毒症的重要靶点，特异性结合prdx1蛋白的结合分子(包括抗prdx1蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体)对于急性器官损伤及脓毒症具有显著的缓解或治疗作用。

35、基于一个总的发明构思，还提供一种prdx1 igg中和抗体在制备急性器官损伤或脓毒症药物中的应用。

36、优选的，所述急性器官损伤包括急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤。

37、更优选的，所述脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤在临床上对应病毒感染导致的急性肝损伤；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤在临床上对应药物、毒素或酒精导致的急性肝损伤。所述脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤的主要表现为先发生炎症为主，其次是氧化应激，细胞变化为先发生凋亡为主，其次是坏死；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤的主要表现为先发生氧化应激为主，其次是炎症，细胞变化为先发生坏死为主，其次是凋亡。

38、所述急性肝损伤包括但不限于脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导或对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤；所述脂多糖/d-氨基半乳糖胺诱导的急性肝损伤的主要表现为炎症、氧化应激或细胞坏死和凋亡，其在临床上对应病毒感染导致的急性肝损伤；所述对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤的表现包括氧化应激、无菌性炎症或细胞坏死和凋亡，其在临床上对应药物、毒素或酒精导致的急性肝损伤。

39、更优选的，所述急性肾损伤包括但不限于肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤；所述肾缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤的主要表现为氧化应激或炎症损伤。

40、更优选的，所述急性肺损伤包括博来霉素诱导、肺炎、非肺源性脓毒症、胃内容物误吸或呼吸机导致的急性肺损伤。

41、优选的，所述prdx1 igg中和抗体治疗急性器官损伤或脓毒症可用于小鼠，但基于不同动物中相似或相同疾病具有相似或相同的致病机理，故此抗体也可用于包括人在内的其他哺乳动物。

42、优选的，所述prdx1 igg中和抗体用于治疗急性肝损伤及急性肾损伤时，用于兔、鼠的给药剂量为300μg/只。

43、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

44、1.本发明利用重组prdx1蛋白免疫兔，从血清中获得抗prdx1蛋白的多克隆中和抗体；其有中和、阻断血清中prdx1的促炎作用，能够治疗急性器官损伤，能够治疗急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤等急性器官损伤及脓毒症；多克隆中和抗体的好处在于它们的效价高，便于人为处理和质量控制，此外，多克隆中和抗体制备相对容易，更为经济；其制备原材料易得，凡是哺乳类都可以免疫产生prdx1 igg中和抗体，提取或重组同源性所有的prdx1蛋白都属于免疫原。

45、2.本发明利用重组prdx1蛋白免疫鼠，得到浆细胞与杂交瘤细胞融合产生抗prdx1蛋白的单克隆中和抗体，其优点在于它们特异性和灵敏度高，得到杂交瘤细胞后可持续得到稳定的产品，具有成药的潜力；也具有中和、阻断血清中prdx1的促炎作用，能够治疗急性肝损伤、急性肾损伤、急性肺损伤等急性器官损伤及脓毒症。