重组XVII型胶原蛋白及其表达菌株的制作方法

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组xvii型胶原蛋白及其表达菌株。

背景技术：

1、胶原蛋白xvii又称bp180，是一种位于真表皮交界处的ii型跨膜蛋白，作为半桥粒(位于真皮-表皮基底膜区的多蛋白复合体，可介导角质形成细胞与下层膜的粘附)中关键的结构成分，对维持基底膜与细胞外基质间的紧密连接具有重要作用。人体中存在两种同源三聚体形式的xvii型胶原蛋白，但均由col17α1基因所编码，分别为全长形式的跨膜蛋白(1497个氨基酸)和截短形式的可溶胞外域(又称lad-1，1009个氨基酸)。其中，胞外域主要介导与层粘连蛋白和iv型胶原蛋白的结合，是参与维持基底膜稳定性的重要部分。在xvii型胶原蛋白胞外域中共存在15个胶原域和16个非胶原域，这些胶原域和非胶原域共同参与执行了与细胞外基质间的相互作用。有研究表明xvii型胶原蛋白的表达可有助于抑制毛囊干细胞的老化，进而延缓脱发。不仅如此，在抗衰方面，有研究发现xvii型胶原蛋白可促进清除衰老细胞，从而延缓机体的衰老。由于xvii型胶原蛋白在人和动物体内含量极低，利用传统的胶原蛋白分离提取工艺显然无法满足市场的需求，开发高效的绿色制造平台大批量生产重组xvii型胶原蛋白对推进稀有胶原蛋白在日化、护肤、保健和医疗等领域的应用具有重要意义。

2、随着合成生物学的快速发展，人为设计构建生物系统已成为现今生物学的主流趋势，而从头设计基因元件模块是合成生物学的基础。基于此理念，结合蛋白质工程理性改造策略，合理设计具有高生物学性能的重组xvii型胶原蛋白，并实现其在异源宿主中的高效表达，将极大有助于xvii型胶原蛋白在工业化生产中的应用。

3、毕赤酵母(pichia pastoris)是至今仅次于大肠杆菌最常见的真核表达系统，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到了成功表达，同时它也被美国fda认定为gras(generally recognized as safe)微生物。此外，毕赤酵母还具备系统的基因编辑系统和完备的蛋白分泌表达机制，是现今广泛应用于食品和医药领域的异源宿主。因此，利用毕赤酵母分泌表达重组xvii型胶原蛋白将大大推进xvii型胶原蛋白在美容护肤、医疗器械和组织工程等领域的发展。

技术实现思路

1、本发明提供一种重组xvii型胶原蛋白及其表达菌株。

2、本发明的技术方案如下：

3、本发明所述的重组xvii型胶原蛋白涉及5个基础功能域，包括seq no.1、seqno.2、seq no.3、seq no.4和seq no.5所示的氨基酸序列，由2个非胶原域和4个胶原域组成。

4、本发明所述的重组xvii型胶原蛋白为由seq no.1、seq no.2、seq no.3和seqno.4的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如seq no.6所示的重组xvii型胶原蛋白1，或由seq no.1、seq no.2、seq no.3、seq no.4和seq no.5的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如seq no.7所示的重组xvii型胶原蛋白2。

5、本发明根据毕赤酵母的密码子偏好性，对5个基础功能域进行密码子优化，得到seq no.1、seq no.2、seq no.3、seq no.4和seq no.5对应的核苷酸序列依次为seq idno.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11和seq id no.12。

6、本发明根据毕赤酵母的密码子偏好性，对重组xvii型胶原蛋白进行密码子优化，得到的重组xvii型胶原蛋白1的核苷酸序列如seq id no.13所示，和重组xvii型胶原蛋白2的核苷酸序列如seq id no.14所示。

7、进一步地，本发明构建表达重组xvii型胶原蛋白的菌株，为合成重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2的核苷酸序列，然后扩增并无缝克隆到ppic9k空载体中，经菌落pcr和测序验证正确后富集重组质粒，酶切线性化后转化到毕赤酵母中，通过g418抗性梯度筛选获得的表达重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌。

8、更进一步地，本发明提供上述重组xvii型胶原蛋白的表达方法，具体为：将表达重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌接种在bmmy培养基中，30℃下经甲醇诱导表达72～120小时，收集上清，纯化得到重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2。

9、本发明通过筛选人源xvii型胶原蛋白中与细胞整合素结合的基础功能域，并将上述基础功能域进行特殊组合，构成重组xvii型胶原蛋白序列，并经密码子优化后扩增克隆到ppic9k载体中，酶切线性化后转化到毕赤酵母细胞中，通过g418抗性梯度筛选高拷贝重组子从而获得能表达重组xvii型胶原蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株。本发明的重组xvii型胶原蛋白1和2能够显著增强人成纤维细胞和人毛囊干细胞增殖、迁移和黏附能力，且重组xvii型胶原蛋白2的效果优于重组xvii型胶原蛋白1。本发明的重组xvii型胶原蛋白可用于皮肤和毛囊组织的修复，提升皮肤和毛囊的抵抗力，适用于制备护发、护肤及相关医药领域应用的产品。

技术特征：

1. 重组xvii型胶原蛋白，其特征在于，为由seq no.1、seq no.2、seq no.3和seq no.4的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如seq no.6所示的重组xvii型胶原蛋白1，或由seq no.1、seq no.2、seq no.3、seq no.4和seq no.5的氨基酸序列按顺序组合所形成的氨基酸序列如seq no.7所示的重组xvii型胶原蛋白2。

2. 根据权利要求1所述的重组xvii型胶原蛋白，其特征在于，重组xvii型胶原蛋白1的核苷酸序列如seq id no.13所示，重组xvii型胶原蛋白2的核苷酸序列如seq id no.14所示。

3.表达权利要求1所述的重组xvii型胶原蛋白的菌株，其特征在于，为合成重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2的核苷酸序列，然后扩增并无缝克隆到ppic9k空载体中，经菌落pcr和测序验证正确后富集重组质粒，酶切线性化后转化到毕赤酵母中，通过g418抗性梯度筛选获得的表达重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌。

4.重组xvii型胶原蛋白的表达方法，具体为：将权利要求3所述的表达重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2的毕赤酵母基因工程菌接种在bmmy培养基中，30℃下经甲醇诱导表达72~120小时，收集上清，纯化得到重组xvii型胶原蛋白1或重组xvii型胶原蛋白2。

技术总结
本发明公开了一种重组XVII型胶原蛋白及其表达菌株。所述的重组XVII型胶原蛋白序列是将人XVII型胶原蛋白中与细胞整合素结合的功能域进行组合所得，分别位于人XVII型胶原蛋白的胶原域和非胶原域，共包含2个非胶原域和4个胶原域，经密码子优化后转化到毕赤酵母中，并经G418抗性梯度筛选获得的高拷贝毕赤酵母基因工程菌能够稳定表达重组XVII型胶原蛋白。本发明的表达重组XVII型胶原蛋白具有优异的促进人毛囊干细胞和人成纤维细胞的细胞增殖、迁移和黏附性能，可用于皮肤和毛囊组织的修复，提升皮肤和毛囊的抵抗力。

技术研发人员：刘枫,赵健烽,黄建民,谭成龙,朱逸丽,赵润贤,费如桂
受保护的技术使用者：浙江诸暨聚源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14