一种耐有机试剂的β-琼胶酶突变体及固定化酶的应用

本发明涉及一种耐有机试剂的β-琼胶酶突变体及固定化酶的应用，属于基因工程技术和酶工程领域。

背景技术：

1、琼脂，又名琼胶，是从江蓠、石花菜等海洋红藻中提取得到的一种具有凝胶特性的多糖。琼胶由具有杂合结构的半乳聚糖家族构成，其主要成分为琼脂糖和琼脂胶。琼脂糖是接近中性的多糖，主要结构由β-d-半乳糖和3,6-无水-α-l-半乳糖的两个残基重复交替连接成的线性多糖分子。研究表明琼胶酶(agarase)能够降解琼胶多糖为聚合度2～10的琼胶寡糖(naos)，而琼胶寡糖具有抗氧化、降血脂、免疫调节、抗过敏及抑制糖苷酶等多种生理活性，是一种极具开发潜力的功能性低聚糖。

2、酶解法因其能够特异性地水解琼脂糖，且无有害化合物生成等优点，被认为是可持续性、规模化生产琼胶寡糖的主要方法。但是大多数自然来源的琼胶酶最适温度在30℃～40℃，而琼脂在38℃时呈凝胶状态，这样会极大地影响琼胶酶的水解效率。在化学合成和交换反应、生化检测项目中，酶会接触一些有机试剂，如：甲醇、二甲亚砜等，这会导致游离酶的有效活性差，且游离琼胶酶存在的其它一些缺点，如热稳定性差，ph范围窄，以及一个循环后催化活性的丧失等都会影响其工业应用价值。而酶固定化技术可以有效提高酶的热稳定性，并且还实现了酶与产物的有效分离，从而更有利于酶反应器的设计，实现酶的再生与循环使用。

3、酶固定化是指通过某种方法将游离的酶限制在特定的空间里或完全负载在特定的支持物上，使酶不能自由的移动，但仍能保持其原有的空间结构和完整的活性中心。该技术通过将酶固定在载体表面或孔洞内，从而得到稳定、可重复使用和活性更高的酶。固定化酶通常具有更优良的性质，例如在苛刻的工业条件下具有更高的酶活性和可重复使用性，因此酶的固定化是一种以低成本实现高反应产率的成功策略。这些优势都使得固定化酶技术受到广泛关注，并实现了相关工业化应用。

4、共价键法是固定化酶研究中应用最广泛的方法，分为随机共价固定及定向共价固定。然而，随机共价固定通常是随机将酶分子上的氨基酸残基(如赖氨酸残基)固定在载体上，这可能会破坏酶的自然构象，或引起空间位阻导致固定化酶的活性大大降低，从而降低生产效率。与随机固定相比，定向固定可以使酶按一定方向(远离活性中心)固定在合适的载体上，从而使酶更好地与底物结合，避免随机固定可能引起的破坏酶的天然构象或造成空间位阻，影响底物进入酶的活性位点，降低酶活性等问题。伴随结构生物学，生物信息学以及计算机计算方式的飞速发展，蛋白质计算设计已经成为改造蛋白质性质的一种可靠手段。因此，通过计算机辅助手段，实现β-琼胶酶的特异位点的定向固定化，从而既可以保证较高的酶活保留率，又可以提高酶的热稳定性，操作稳定性以及在有机试剂中的有效活性，最终得到具有较高实际工业应用潜力的β-琼胶酶。

技术实现思路

1、本发明利用计算机辅助手段，对野生型来源于saccharophagus degradans 2-40的β-琼胶酶进行突变，将所选定的突变位点突变为半胱氨酸，然后利用β-琼胶酶表面特定位点的半胱氨酸的巯基特异性地与载体结合，实现β-琼胶酶的特异位点的定向固定化，从而既可以保证较高的酶活保留率，又可以提高酶的热稳定性及操作稳定性，得到了热稳定性显著增强、可重复使用以及能够有效的抵抗有机试剂对于酶活的影响的固定化β-琼胶酶，赋予β-琼胶酶更大的工业应用价值。

2、本发明提供了一种琼胶酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如seq id no.2所示的琼胶酶亲本酶的第308位的赖氨酸突变为半胱氨酸得到的，命名为e308c；

3、或将氨基酸序列如seq id no.2所示的琼胶酶亲本酶的第558位的天冬酰胺突变为半胱氨酸得到的，命名为s558c。

4、或将氨基酸序列如seq id no.2所示的琼胶酶亲本酶的第588位的天冬酰胺突变为半胱氨酸得到的，命名为k588c。

5、在本发明的一种实施方式中，所述琼胶酶亲本酶的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、本发明还提供了一种编码上述突变体的基因。

7、本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

8、在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以pet-28a为表达载体。

9、本发明还提供了一种上述突变体，或含有上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。

10、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以原核细胞或真核细胞为表达宿主。

11、在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为大肠杆菌。

12、本发明还提供了一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达了上述琼胶酶突变体。

13、本发明还提供了一种固定化琼胶酶，所述固定化琼胶酶是将上述琼胶酶突变体与巯基修饰的磁性纳米颗粒混合孵育制备得到。

14、本发明提供了一种选择性固定β-琼胶酶突变体的方法，该方法包括以下步骤：

15、(1)氨基化磁性纳米颗粒载体的制备；

16、(2)巯基修饰的磁性纳米颗粒制备；

17、(3)利用载体表面巯基和β-琼胶酶表面cys基团上的游离巯基可形成分子间二硫键从而固定β-琼胶酶于磁性纳米颗粒上，即：将步骤(2)制备得到的磁性纳米颗粒与上述β-琼胶酶突变体孵育后制备得到固定化β-琼胶酶突变体。

18、在本发明的一种实施方式中，所述方法的具体步骤为：

19、(1)氨基化磁性纳米颗粒载体的制备：

20、溶剂热法制备磁性纳米颗粒：将fecl3·6h2o溶解与乙二醇中，然后加入醋酸钠和壳聚糖，将混合物搅拌，然后密封在高压釜中；在200℃加热8h，冷却至室温后用乙醇多次洗涤，在60℃干燥6h；

21、(2)巯基修饰的磁性纳米颗粒制备：

22、将traut试剂加入氨基化磁性纳米颗粒，将混合物在25℃水浴震荡12h，得到巯基修饰的磁性纳米颗粒；

23、(3)利用巯基可与突变酶cys残基之间形成二硫键从而定向固定β-琼胶酶于磁性纳米颗粒上：

24、将步骤(2)制备得到的磁性纳米颗粒加入琼胶酶突变体溶液中，混合物在25℃震荡24h，反复洗涤，得到固定化β-琼胶酶。

25、本发明还提供了一种提高固定化酶热稳定性和有效抵抗有机试剂对固定化酶影响的方法，所述方法为：

26、(1)制备β-琼胶酶突变体：

27、以含有原始酶的质粒为模板，采用引物序列进行定点突变，分别得到e308c、s558c和k588c突变体；

28、(2)将步骤(1)得到的琼胶酶突变体与经氨基化及巯基修饰的磁性纳米颗粒混合孵育制备得到固定化琼胶酶。

29、本发明还提供了上述琼胶酶突变体、或上述基因、或上述重组载体、或上述重组细胞、或上述固定化琼胶酶在制备琼胶低聚糖或含有琼胶低聚糖的产品中的应用。

30、在本发明的一种实施方式中，所述应用为，将所述琼胶酶突变体或重组细胞或固定化琼胶酶，添加至含有琼胶的反应体系中，制备得到。

31、有益效果

32、(1)本发明在对野生型来源于saccharophagus degradans 2-40的琼胶酶及本发明的突变体进行表征和固定化后，得到了热稳定性增强、可重复利用和能够有效的抵抗有机试剂对于酶活的影响的固定化β-琼胶酶突变体，赋予β-琼胶酶更大的工业应用价值。本发明在进行表征和固定化之后，得到了相较于游离酶，耐热性更高、且能够有效的抵抗有机试剂对于酶活的影响的突变体固定化酶，大大提升了琼胶酶在工业上的应用前景。

33、(2)对于固定化突变型酶e308c、s558c、k588c，在40℃下，水浴30min后，固定化酶的相对酶活分别为95.0％、88.3％、95.0％，而游离酶为79.8％；水浴60min后游离酶的相对酶活进一步降低至37.8％，固定化突变型酶e308c、s558c、k588c分别保留了85.5％、78.1％、95.0％的相对酶活；水浴6h后，固定化突变型酶e308c、s558c、k588c仍然分别保留了最初酶活的63.1％、66.2％、69.6％，而游离酶几乎丧失所有酶活；可见，本发明的固定化酶的稳定性明显提高。

34、(3)在50％甲醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇、二恶烷、无水乙醇、二甲亚砜和丙酮有机试剂中孵育30min后，游离酶都丧失了全部的活力。固定化突变型β-琼胶酶，在相同的有机试剂中孵育30min后，所有的固定化突变型β-琼胶酶几乎都恢复了酶活力。且在50％正丙醇、二甲亚砜的有机试剂中，所有的固定化突变型β-琼胶酶都恢复了80％以上的酶活。可见，本发明的固定化酶能够有效的抵抗有机试剂对于酶活的影响。