一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法。

背景技术：

1、褐飞虱是水稻重大害虫之一，不仅可以刺吸汁液为害，还可以传播病毒病为害。准确的虫情预测预报是害虫防治的关键，测报灯下褐飞虱的始见日、迁入量、迁入峰是预测预报的关键依据，也是褐飞虱防治策略制定的关键信息依据。伪褐飞虱和拟褐飞虱是褐飞虱的同属近似种，并不取食水稻，但也具有扑灯习性。褐飞虱(nilaparvata lugens，n1)、伪褐飞虱(nilaparvata muiri，nm)和拟褐飞虱(nilaparvata bakeri，nb)形态、体色和外部特征均非常相似，肉眼难以区分，需专业人员借助显微镜根据颜面和生殖器特征才能鉴别。人工进行褐飞虱属近似种鉴定耗时费力，对人员专业技能要求高，且不能鉴别残缺的飞虱个体。

2、基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)技术的核酸检测为物种的鉴定提供了新的手段，弥补了传统形态学鉴定的诸多不足。文献报道(崔亚丽.褐飞虱及其两近似种的生物学及分子标记的研究[d].北京：中国农业科学院，2012，pp：26-39.)，利用核糖体间隔区基因(internal transcribed spacer，its)设计引物，初步建立了褐飞虱、拟褐飞虱和伪褐飞虱的多重pcr检测技术(需pcr仪+电泳仪+凝胶成像仪)，由于是以纯基因组dna为模板，具有耗时长、耗费大等缺点。liu等(liu s h，luo j，liu r，etal.identification of nilaparvata lugens and its two sibling species(n.bakeriand n.muiri)by direct multiplex pcr[j].journal of economic entomology，2018，111(6)：2869-2875.)在此基础上，重新设计引物对，以加水研磨的粗组织液为模板建立了三种飞虱的直接多重pcr检测方法(需pcr仪+电泳仪+凝胶成像仪)，该方法不需要提取dna，将检测时间大大缩短。这两种方法虽然都能准确的鉴定褐飞虱，但都依赖于昂贵的仪器设备，不易推广应用。罗举等(罗举，唐健，王爱英，等.基于重组酶介导扩增-侧流层析试纸条的褐飞虱快速鉴定方法.中国水稻科学，2022，36：96-104.)建立了基于重组聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，rpa)和侧流层析试纸条(lateral flowdipstick，lfd)的褐飞虱快速鉴定技术，可在不借助任何仪器的情况下12分钟内完成检测。rpa-lfd方法可以实现褐飞虱的快速精准鉴定，且摆脱了对精密仪器的依赖，但因需要结合试纸条才能实现肉眼检测，成本较高。而且，该方法只能区分褐飞虱与非褐飞虱，并不能准确鉴定是伪褐飞虱或拟褐飞虱。

3、因此，有必要进一步开发可以准确鉴定褐飞虱、伪褐飞虱和拟褐飞虱的经济快速的快速检测技术。

技术实现思路

1、本发明针对诱虫灯下褐飞虱与其近似种难以快速区分鉴定的难题，提供一种操作简单、快速、可视化鉴定褐飞虱及其近似种所需的现场即时检测方法及试剂盒。

2、为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

3、一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的靶标，所述靶标为三条序列组成的靶标组合，核苷酸序列具体如下：

4、(1)nl：序列如seq id no.1所示；

5、(2)nm：序列如seq id no.2所示；

6、(3)nb：序列如seq id no.3所示。

7、本发明还提供了所述的靶标在鉴别褐飞虱属飞虱物种中的应用。

8、优选的，所述褐飞虱属飞虱物种为褐飞虱(nilaparvata lugens)、伪褐飞虱(nilaparvata muiri)和拟褐飞虱(nilaparvata bakeri)。

9、本发明还提供了一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的引物组合，包括以下3组，其外引物和内引物的核苷酸序列具体如下：

10、(1)nl：外引物序列如seq id no.4～5所示，内引物序列如seq id no.6～7所示；

11、(2)nm：外引物序列如seq id no.8～9所示，内引物序列如seq id no.10～11所示；

12、(3)nb：外引物序列如seq id no.12～13所示，内引物序列如seq id no.14～15所示。

13、本发明还提供了一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的试剂盒，包括所述的引物组合。

14、本发明还提供了一种用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法，包括以下步骤：

15、(1)制备待测样本粗组织液；

16、取单头待测飞虱，放入离心管中，加入蒸馏水，用研磨棒或枪头轻轻研磨；研磨液无需离心即为粗组织液；

17、(2)制备用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的引物反应单元；其中，褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.4～5所示，内引物的核苷酸序列如seq idno.6～7所示；伪褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.8～9所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.10～11所示；拟褐飞虱引物反应单元检测使用的外引物的核苷酸序列如seq id no.12～13所示，内引物的核苷酸序列如seq id no.14～15所示；

18、(3)使用hnb变色法进行检测，若褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为褐飞虱；若伪褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为伪褐飞虱；若拟褐飞虱引物反应单元呈现天蓝色，说明待测样品为拟褐飞虱；若各反应单元均呈现紫色，说明待测样本不是褐飞虱、伪褐飞虱或拟褐飞虱中的一种。

19、具体的，hnb变色法反应体系为：100mm硫酸镁1μl，无镁离子的10×buffer 2.5μl，10mm的dntp 3.5μl，5m的betaine 3μl，10μm内引物4μl，5μm外引物1μl，1.25mm羟基萘酚蓝1μl，8u/μl的bst 2.0 1μl，待测样本粗组织液1μl，ddh2o补充至25μl。

20、所述hnb变色法反应体系中的内引物和外引物均为混合物，其中所述内引物为两条内引物的混合物，体积比例为1∶1，所述外引物为两条外引物的混合物，体积比例为1∶1。

21、hnb变色法反应条件为：65℃恒温扩增30～50分钟。

22、用于鉴别褐飞虱属飞虱物种的方法中，还包括阴性对照和阳性标准品的测定；当阴性对照为紫色、阳性标准品为天蓝色条件下，结果判读有效。

23、本发明的有益效果：

24、本发明是在生物信息学分析的基础上，筛选三种飞虱的物种特异性基因并设计引物开发的试剂盒，具有高度的物种特异性。本方法采用环介导恒温扩增技术进行靶标基因的恒温扩增，采用羟基萘酚蓝(hnb)变色法，实现扩增产物的可视化检测，降低了对仪器设备的要求，降低了操作难度，摆脱了对专业分类技能的依赖。综上所述，本发明的飞虱快速检测和鉴定方法具有准确、操作简便、快速，对操作人员要求不高等优点，较传统的形态学鉴定方法具有更高的可重复性，易操作性和时效性。