一种具有宽极性检测范围比率型荧光探针及其制备和应用

本发明属于有机小分子荧光探针和生物传感，涉及一种具有宽极性检测范围的比率型荧光探针；本发明还涉及一种该比率型荧光探针的制方法及应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默病（ad）是最常见的神经退行性疾病之一。但是当ad病程到达晚期时，暂时还没有有效的药物可以治愈这种疾病。之前，ad治疗的靶点主要是β-淀粉样蛋白（aβ）和乙酰胆碱酯酶。针对ad发展的荧光探针也主要是基于aβ、ros和rss等。神经元极性异常是阿尔茨海默病的主要组织病理学事件之一，而用于检测ad极性的荧光探针还未见报道。

2、荧光成像由于其高灵敏度、无创、无放射性、低毒性和实时监测等优点引起广泛关注。荧光探针被认为是一种有前途的用于研究ad的工具。比率型荧光探针具有两个不同的荧光发射，相对于只依赖荧光强度变化的荧光探针更不容易受到探针浓度、环境和仪器的干扰，检测精度高，能提供更准确的病理信息。

3、近年来，越来越多的具有靶向亚细胞器能力的比率型荧光探针被开发出来。但是像尼罗红这样的中性分子，可用于检测极性的比率型荧光探针实是罕见的。因为带电荷的分子容易具有靶向亚细胞器性能，脂溶性的分子容易具有靶向脂滴的性能。再加上大多数极性探针的设计原理是基于分子内电荷转移（ict）和扭曲的分子内电荷转移（tict）机理，所以这类荧光探针的共性是随着溶剂极性的增加，探针的荧光量子产率（φf）降低，不便于在高极性环境中检测。虽然之前有研究工作分别将低和高极性的探针通过化学键连接在一起，形成了宽极性检测范围的单分子荧光探针，但合成繁琐，限制了其应用。

4、因此，迫切需要开发具有宽极性检测范围的比率型荧光探针，并用于监测细胞和ad鼠中大脑的极性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种能在高极性环境中检测的具有宽极性检测范围比率型荧光探针。

2、本发明的第二个目的是提供一种上述荧光探针的制备方法。

3、本发明的第三个目的是提供一种上述荧光探针的应用。

4、为此，本发明所采用的技术方案是：一种具有宽极性检测范围比率型荧光探针，简记为hcy7-k，以cy7-cl为前体，其结构式为：

5、

6、本发明所采用的第二个技术方案是：一种上述荧光探针的制备方法，具体按以下步骤进行：

7、步骤1：按摩尔比1︰1.5，分别取2,3,3-三甲基-3h-吲哚和碘乙烷，混合均匀，120℃温度下加热24 h，自然冷却至室温，过滤，用环己烷清洗，得粉色晶体状的化合物1；

8、步骤2：按体积比1︰1混合n, n-二甲基甲酰胺和二氯甲烷，冰浴中冷却15 min，得混合液体；

9、再按20ml的n, n-二甲基甲酰胺需用5 g环己酮的比例，取环己酮；

10、按体积比6︰5，分别取三氯氧磷和二氯甲烷，将三氯氧磷溶于二氯甲烷中，得溶液；

11、将溶液缓慢滴加至混合液体中，搅拌30 min，再加入环己酮，回流3 h，自然冷却至室温，倒入冰水中，静置10 h，析出黄色沉淀，过滤，干燥，得化合物2；

12、步骤3：按1.00g化合物2需用3.65 g化合物1、15 ml乙酸酐和0.95 g乙酸钠的比例，分别取化合物2、化合物1、乙酸酐和乙酸钠；在氮气保护下，将化合物2加入乙酸酐中，搅拌使化合物2溶于乙酸酐，然后再加入化合物1和乙酸钠，加热至130℃保温1h，有沉淀析出，无需降温，直接趁热过滤，并用乙醚洗涤三次，得具有金属光泽的墨绿色固体cy7-cl；

13、步骤4：按37.8 mg的nabh4需用51.1mg的cy7-cl、30ml甲醇、10ml再次加入的水和20ml二氯甲烷的比例，分别取nabh4、cy7-cl、再次加入的水和二氯甲烷，将nabh4完全溶于水中，得水溶液，将cy7-cl溶于甲醇中，得含有cy7-cl的甲醇溶液，在搅拌的条件下将该水溶液慢慢滴加于含有cy7-cl的甲醇溶液中，滴加过程中，观察反应体系颜色，当反应体系颜色变为红色后，停止滴加，继续搅拌30 min，旋蒸除去甲醇，再加入再次加入的水和二氯甲烷，产物溶解在二氯甲烷中，多余的nabh4溶解在再次加入的水中，用分液漏斗萃取，粗产物经柱层析[二氯甲烷︰甲醇= 10︰1（体积比）作为洗脱剂]，制得红色的具有宽极性检测范围比率型荧光探针（hcy7-k）（k代表酮）。

14、本发明比率型荧光探针hcy7-k的合成路线如下：

15、

16、本发明所采用的第三个技术方案是：一种上述比率型荧光探针在检测溶液极性中的应用，即作为检测试剂检测的溶液极性，具体是检测细胞极性变化和揭示ad鼠脑部的极性异常时作为检测试剂。

17、本发明通过分子设计得到一种含有中性醌结构的荧光探针，该荧光探针具有在低极性环境中以中性醌形式存在，高极性环境中以芳香阴阳离子形式存在的能力。在高极性环境和低极性环境中都有较高的φf、良好的极性响应能力、优异的选择性和良好的生物相容性。能在共聚焦荧光显微镜下成像脂多糖（lps）刺激条件下，n2a细胞（小鼠来源神经瘤母细胞）的极性变化，并能揭示ad小鼠脑部的极性异常。

18、本发明比率型荧光探针具有如下优点：

19、1）在高极性环境中仍保持高的φf，适用于宽极性范围的监测。

20、2）具有良好的生物相容性、优异的选择性和极性依赖性。

21、3）作为中性分子，hcy7-k没有明显的细胞器靶向倾向。

技术特征：

1.一种具有宽极性检测范围比率型荧光探针，其特征在于，简记为hcy7-k，其结构式为：

2.一种权利要求1所述的具有宽极性检测范围比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，按以下步骤：

3.如权利要求2所述的具有宽极性检测范围比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，有沉淀析出，无需降温，直接趁热过滤。

4.如权利要求2所述的具有宽极性检测范围比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，柱层析时的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，该混合物中二氯甲烷︰甲醇的体积比为10︰1。

5.一种权利要求1所述的具有宽极性检测范围比率型荧光探针在检测溶液极性中的应用。

6.如权利要求5所述的具有宽极性检测范围比率型荧光探针的应用，其特征在于，该比率型极性荧光探针作为检测试剂检测的溶液极性。

7.如权利要求6所述的具有宽极性检测范围比率型荧光探针的应用，其特征在于，该比率型极性荧光探针在检测n2a细胞极性中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有宽极性检测范围比率型荧光探针及其制备和应用，探针简记为HCy7‑K，用2,3,3‑三甲基‑3H‑吲哚和碘乙烷制备化合物1；用N,N‑二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯氧磷、二氯甲烷和环己酮制备化合物2；氮气保护下，将化合物2溶于乙酸酐，加入化合物1和乙酸钠，加热保温，得Cy7‑Cl；NaBH<subgt;4</subgt;溶于水，得水溶液，Cy7‑Cl溶于甲醇后，缓慢滴加该水溶液，该反应体系变为红色，停止滴加，继续搅拌，旋蒸，加水和二氯甲烷，萃取，柱层析，制得红色的具有宽极性检测范围比率型荧光探针。该荧光探针应用于检测N2a细胞极性。该荧光探针在高极性环境中仍保持高的Φ<subgt;f</subgt;，适用于宽极性范围的监测。

技术研发人员：汪宝堆,孙盼盼,胡国文,陈海超,郭文婷,高宁双
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15