调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用

本发明属于生物，具体涉及调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用。

背景技术：

1、水稻作为世界上三大粮食作物之一，其总产量位于世界第二。据统计，世界上有超过50％的人口以稻米为主食[1]。因此，如何让人们吃到更加优质、更加安全的稻米，是当今水稻育种工作的重要目标。镉(cadmium，cd)是人体非必需元素，其可以通过食物链在人体内富集，长期积累可导致骨质疏松症、肾功能障碍和癌症等多种疾病。随着工业化的快速发展以及化肥和农药的过度使用，土壤中不断增加的cd污染已经严重威胁到粮食安全，增加了对人类健康的潜在风险[2]。因此，研究植物吸收cd的分子机理并筛选和培育耐cd胁迫或低cd累积的农作物，有益于人类健康和生态保护。

2、由于在植物中没有特定的cd转运体，cd通过广泛的阳离子转运系统被植物吸收。osnramp5(resistance-associatedmacrophage protein，nramp)是水稻植株锰(mn，manganese)和cd的主要转运体，负责将mn和cd从外部溶液运输到根细胞中，其敲除系则失去了吸收mn和cd的能力[3]。mn是植物生长的必需元素，故后续研究水稻植株对于cd的积累特性的同时，也应时刻关注植株及籽粒中mn含量的变化。

3、金属伴侣蛋白通常是可溶性的细胞内蛋白，它与金属离子紧密结合，以防止与其他细胞元素发生有害反应，确保金属离子在细胞内安全地运输，在金属稳态和解毒过程中起着至关重要的作用[4]。但目前对于金属伴侣蛋白rlc(loc_os04g39350)在水稻cd胁迫下的功能还未有报道，是否可用于低镉水稻育种尚不清楚。

4、参考文献：

5、1.sakamoto,t.&matsuoka,m.identifying and exploiting grain yield genesin rice.

6、curr.opin.plantbiol.11,209–214(2008).

7、2.kirkham,m.b.cadmium in plants on polluted soils:effects of soilfactors,

8、hyperaccumulation,and amendments.geoderma 137,19–32(2006).

9、3.sasaki,a.,yamaji,n.,yokosho,k.&ma,j.f.nramp5 is a major transporter

10、responsible for manganese and cadmium uptake in rice.plant cell 24,

11、2155–2167(2012).

12、4.robinson,n.j.&winge,d.r.copper metallochaperones.annu.rev.biochem.

13、79,537–562(2010).

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供调控水稻籽粒重金属含量的基因及应用，敲除rlc基因后可以显著降低籽粒中的cd含量，而不影响籽粒中mn含量。

2、本发明提供了一种调控水稻籽粒重金属含量的rlc基因，所述rlc基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、优选的，所述重金属的种类包括镉。

4、本发明还提供了上述rlc基因在培育与镉含量相关水稻种质中的应用。

5、优选的，敲低所述rlc基因的表达或敲除所述rlc基因后水稻籽粒中镉含量降低。

6、本发明还提供了一种降低水稻籽粒中镉含量的方法，包括以下步骤：敲低所述rlc基因的表达或敲除上述rlc基因。

7、优选的，所述敲低或敲除的方法包括基因编辑。

8、优选的，当采用crispr/cas9基因编辑技术进行所述敲低或敲除时，基因编辑靶点的核苷酸序列如seq id no.7所示和seq id no.10所示。

9、本发明还提供了水稻rlc基因crispr-cas9基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以pylsgrna-osu3载体为模板，分别利用第一引物对和第二引物对进行第一pcr扩增；以第一pcr扩增产物的混合物为模板，利用第三引物对进行第二pcr扩增；以第二pcr扩增产物为模板，利用第四引物对进行第三pcr扩增，得u3；所述第一引物对包括序列如seqid no.6所示的u-f和seq id no.7所示的rlc-osu3t1 target；所述第二引物对包括序列如seq idno.8所示的rlc-grt1和seq id no.9所示的gr-r；所述第三引物对包括u-f和gr-r；所述第四引物对包括序列如seq id no.12所示的pps-ggl和seq idno.13所示的pgs-gg2；

10、(2)以pylsgrna-osu6a载体为模板，分别利用第五引物对和第六引物对进行第一pcr扩增；以以第一pcr扩增产物的混合物为模板，利用第三引物对进行第二pcr扩增；以第二pcr扩增产物为模板，利用第七引物对进行第三pcr扩增，得u6；所述第五引物对包括u-f和序列为seq id no.10所示的rlc-osu6at2 target；所述第六引物对包括序列为seq idno.11所示的rlc-grt2和gr-r；所述第七引物对包括序列为seq id no.14所示的pps-gg2和seq id no.15所示的pgs-ggr；

11、(3)将所述u3和u6分别利用bsaⅰ酶切后，进行连接，得rlc基因敲除双元载体；

12、步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后关系。

13、本发明还提供了利用上述构建方法得到的rlc基因敲除双元载体。

14、本发明还提供了一种培育低镉含量水稻种质的方法，包括以下步骤：将上述rlc基因敲除双元载体转化至水稻中，将得到的抗生素抗性愈伤组织进行组织分化，得到的rlc基因敲除转基因水稻材料为所述低镉含量水稻种质。

15、有益效果：本发明提供了一种调控水稻籽粒重金属含量的rlc基因，所述rlc基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明所述rlc基因在不同浓度的重金属镉胁迫处理条件下均能被诱导表达，表现出时间依赖性，随着胁迫时间的增长，其诱导表达量也显著提高。

16、本发明实施例中还利用基因编辑的方法构建了敲除rlc的水稻材料rlc，在cdcl2环境中培养一段时间后，无论是地上部还是地下部分的镉含量都显著低于野生型；收获籽粒后测定糙米镉含量，结果显示rlc敲除株系水稻镉含量显著下降，说明rlc在调控水稻籽粒中镉的积累过程中发挥了重要作用；同时不影响籽粒中的mn含量。对rlc水稻植株和野生植株进行农艺性状的对比，无显著差异，因此本发明可为培育低镉水稻提供一种有效方法，解决了低镉水稻遗传资源偏窄的问题。不影响水稻产量的前提下，降低土壤cd积累对于水稻植株以及籽粒的重金属污染问题。