一种利用地衣芽孢杆菌连续制备D-阿洛酮糖的方法与流程

本发明涉及一种利用地衣芽孢杆菌连续制备d-阿洛酮糖的方法，属于生物。

背景技术：

1、d-阿洛酮糖分子量为180.16，熔点为96℃，易溶于水，甜度约为蔗糖的70％，在结构上与d-果糖的c-3位存在差异。不同于传统甜味剂，当d-阿洛酮糖被摄入人体后，70％会通过尿液或粪便直接排出，产生的能量仅为等量蔗糖的0.3％，无消化负担，对人体不构成健康威胁。

2、早期的d-阿洛酮糖采用化学合成得到。生物转化法具有反应条件温和、副产物少、纯化步骤简单、绿色环保等优点，已成为d-阿洛酮糖合成的主要方向。目前d-阿洛酮糖的生物转化主要利用大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌等宿主表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶(d-psicose 3-epimerase)，再利用细胞破碎获得纯酶，以d-果糖为底物转化合成d-阿洛酮糖。这种生产方式中，作为催化剂的纯酶仅能使用一次，且为产物的分离带来了不便。

3、目前利用全细胞转化合成d-阿洛酮糖的报道比较少，主要使用的宿主细胞也为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌等。全细胞催化省去了发酵后细胞破碎的步骤，而且催化剂可以通过离心或过滤很方便地与产物进行分离。然而，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或枯草芽孢杆菌的细胞在60-70℃的催化温度下容易裂解；即使对细胞进行回收，在过程中极易感染噬菌体。因此，全细胞催化剂难以实现重复利用。

4、另一方面，d-阿洛酮糖3-差向异构酶催化的d-果糖生成d-阿洛酮糖的反应为可逆反应，反应达到平衡时大约一半的果糖未被转化。基于两种糖的结构相似性，反应后产物的提取纯化是生产的技术难点。

5、模拟移动床色谱分离技术是20世纪60年代提出的一种现代化分离技术，它采用多柱逆流的操作模式克服了单柱间歇制备色谱高溶剂消耗和低生产效率的缺点，是最适于连续性大规模工业化生产的色谱技术之一。专利cn202111164114.6(利用模拟移动床从混合糖浆中分离阿洛酮糖的方法)公布了一种利用模拟移动床从混合糖浆中分离阿洛酮糖的方法。然而该方法需要首先通过催化获得含d-阿洛酮糖的混合糖浆，待可逆反应达到平衡后，再使用模拟移动床进行分离提取，生产过程不具备连续性。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种可以进行多批次、高温反应及长时间微滤处理的重组地衣芽孢杆菌细胞的培养方法。

2、本发明提供一种用于连续化生产d-阿洛酮糖的装置，由配料罐、反应罐、微滤装置、模拟移动床、催化补充装置剂等组件组成，其中，配料罐用于配制一定浓度的果糖溶液，反应罐用于果糖溶液和细胞催化剂的混合及反应，微滤装置用于截留回收反应液中的细胞催化剂，模拟移动床用于反应液中底物果糖和产物阿洛酮糖的分离，这些组件之间以不锈钢管道连接。

3、所述模拟移动床包含6个色谱柱和多个阀门，每个色谱柱内装填分子筛树脂，色谱柱之间由高压气管首尾相连，第6个色谱柱后设一循环泵，将含有底物d-果糖的分离组分回流至配料罐用于连续催化；各色谱柱由夹套通入热水循环保温；每个色谱柱由4个电磁阀分别控制abcd共4个进出料端口，所述4个进出料端口分别是用于洗脱的纯水进口(a)、用于流入经微滤获得的清液的进口(b)、用于流出富含d-果糖底物组分的出口(c)和用于流出富含产物d-阿洛酮糖组分的出口(d)。

4、本发明的第二个目的在于提供一种将细胞催化反应和产物色谱分离偶联的d-阿洛酮糖连续制备方法，该方法包括如下步骤：

5、(1)发酵重组地衣芽孢杆菌，回收重组地衣芽孢杆菌细胞作为催化剂；

6、(2)用缓冲液在配料罐中配制d-果糖溶液；可以用含有5mm co2+和mn2+的50mmhepes缓冲液(ph 8.5)配置50％(w/w)的果糖溶液；

7、(3)将d-果糖溶液与一定量的细胞催化剂混合，以一定流速泵入反应罐，再从反应罐泵入微滤装置；微滤获得的清液进入串联于微滤装置之后的模拟移动床以分离底物d-果糖和产物d-阿洛酮糖，而微滤截留的含细胞催化剂的混液则回流至反应罐进行连续反应；

8、d-果糖溶液与细胞催化剂混合后，d-果糖的质量浓度为16.7-30％，细胞密度为od600＝5；

9、所述模拟移动床的控制条件可以是ab流量比为2:1～5:4，cd流量比为2:1～1:2，d-阿洛酮糖溶液的出口流速vp＝0.6-1.5l/h，回混流量为2-3l/h，电磁阀切换时间269～762s；所述电磁阀切换时间是指从ab阀门打开至切换为cd阀门打开的时间间隔。

10、(4)将模拟移动床分离获得的d-阿洛酮糖进一步粗提及精制，而d-果糖与混液一起回流至配料罐用于连续反应。所述粗提及精制包括干燥和结晶。

11、所述微滤装置用于截留回收反应液中的细胞催化剂以分离细胞催化剂与糖液，可以选择板式、管式(内压列管式和外压管束式)、卷式、中空纤维式等形式。

12、优选的，进口a的进水流量为1.42l/h，进口b的清液进料流量为0.57l/h，ab流量比为5:2，出口c的d-果糖出口流量为1.33l/h，出口d的d-阿洛酮糖出口流量为0.67l/h，回混流量是2l/h，电磁阀切换时间为739s，操作温度为60℃。

13、[有益效果]

14、通过上述技术方案，本发明既实现了细胞催化剂的连续式重复利用，降低了催化剂的使用成本(1l发酵液得到的细胞催化剂可制备100kg阿洛酮糖)；又通过偶联基于模拟移动床的连续式分离系统，持续将反应体系中产物d-阿洛酮糖浓度降低至反应平衡浓度30％以下，提高底物d-果糖的浓度，将可逆反应的平衡向产物合成的方向推动，显著提高了催化效率。

15、地衣芽孢杆菌是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被fda认证为“generally regarded as safe”(gras)安全级别。另一方面，该菌株是一种典型的耐热微生物，可以在50℃生长，培养好的细胞在60-70℃稳定性极好，且极少存在噬菌体感染的问题。利用重组地衣芽孢杆菌作为细胞催化剂，稳定性与基于模式微生物(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)的细胞催化机相比显著提高，可以实现d-阿洛酮糖的连续化生产。

技术特征：

1.用于连续化生产d-阿洛酮糖的装置，其特征在于，包括配料罐、反应罐、微滤装置、模拟移动床、催化剂补充装置，其中，配料罐用于配制果糖溶液，反应罐用于果糖溶液和细胞催化剂的混合及反应，微滤装置用于截留回收反应液中的细胞催化剂，模拟移动床用于分离反应液中的底物果糖和产物阿洛酮糖；

2.根据权利要求1所述的用于连续化生产d-阿洛酮糖的装置，其特征在于，所述色谱柱有6个。

3.应用权利要求1或2所述装置连续制备d-阿洛酮糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用含有5mm co2+和mn2+的50mm hepes ph8.5的缓冲液配置50％(w/w)的果糖溶液。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微滤装置是板式、管式、卷式或中空纤维式。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，d-果糖溶液与细胞催化剂混合后，d-果糖的质量浓度为30％，细胞密度为od600＝5。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述模拟移动床的色谱柱的ab进口的流量比为2:1～5:4，cd出口的流量比为2:1～1:2，电磁阀切换时间269～762s；所述电磁阀切换时间是指从ab阀门打开至切换为cd阀门打开的时间间隔。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，d-果糖与混液的回混流量为2-3l/h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，进口a的进水流量为1.42l/h，进口b的清液进料流量为0.57l/h，出口c的d-果糖出口流量为1.33l/h，出口d的d-阿洛酮糖出口流量为0.67l/h，回混流量是2l/h，电磁阀切换时间为739s，操作温度为60℃。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述粗提及精制包括干燥和结晶。

技术总结
本发明公开了一种利用地衣芽孢杆菌连续制备D‑阿洛酮糖的方法，属于生物技术领域。包括以下步骤：发酵重组地衣芽孢杆菌，回收细胞作为催化剂；在配料罐中配制D‑果糖溶液；将果糖溶液与细胞催化剂混合，泵入微滤装置；使微滤获得的清液进入串联于微滤装置的模拟移动床以分离底物和产物，而含细胞催化剂的混液回流至反应罐进行连续反应；模拟移动床分离获得的D‑阿洛酮糖进一步粗提及精制，而D‑果糖与混液一起回流至配料罐连续反应。本发明采用的地衣芽孢杆菌细胞催化剂在高温下可稳定地连续重复使用。微滤装置与模拟移动床的串联，将可逆反应的平衡持续向产物合成的方向推动，反应效率高，适合工业规模的连续化生产。

技术研发人员：李由然,石贵阳,吴志勇
受保护的技术使用者：无锡特殊食品与营养健康研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15