一种茶树纤维素合成酶基因启动子、克隆方法及其应用

本发明属于植物基因工程，尤其涉及一种茶树纤维素合成酶基因启动子、克隆方法及其应用。

背景技术：

1、目前，茶树是多年生的常绿经济林木，利用其新梢加工而成的茶叶每年消耗量仅次于纯水。加工茶叶的茶树鲜叶一般为幼嫩的新梢，利用成熟度较高的鲜叶加工而成的茶叶外形不够优雅，并且品质较差。因此在茶树品种选育时会考虑其新梢的“持嫩性”，也就是茶树新梢保持嫩度的能力。茶树的“持嫩性”与其纤维素、半纤维素和木质素等物质的积累密切相关。纤维素是由质膜上的纤维素合酶(cesa)复合物合成的，因此，如何调控茶树中纤维素的合成对于茶树资源的高效利用有着重大意义。

2、启动子是rna聚合酶特异性识别和结合的dna序列，是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，绝大多数基因在调控表达上与其调控元件相关，而且呈现出空间性和时间性的特点。目前，植物基因工程研究的主要内容是基因的表达和调控，但外源基因表达量不足是不能理想获得转基因植物的重要原因。启动子在决定基因表达方面起着关键作用，因此研究植物启动子是增强外源基因表达的首要问题。

3、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

4、1)外源基因表达量不足：由于外源基因在转基因植物中的表达量不足，可能导致目标性状无法达到预期效果。这可能是因为启动子的选择不合适，或者转基因过程中发生了某些未知的影响。

5、2)启动子选择有限：目前可用于植物基因工程的启动子种类有限，这限制了研究人员在基因表达调控方面的选择。为了解决这个问题，需要开发和筛选更多具有不同功能和特性的启动子。

6、3)转基因植物安全性和环境影响：转基因植物的安全性和可能对环境产生的影响一直是人们关注的问题。虽然现有技术已经在很大程度上解决了这些问题，但仍需要进一步研究和完善，以确保转基因植物的安全使用。

7、4)基因表达调控机制复杂：植物基因表达调控是一个非常复杂的过程，涉及多种信号通路、转录因子和调控元件。现有技术在这方面的研究尚不完善，需要进一步深入了解基因表达调控的机制以提高转基因植物的研究效果。

8、5)抗性问题：长期使用同一种转基因植物可能导致抗性问题，例如作物抗虫性下降或者病害抗性减弱。为应对这个问题，需要研发更多种类的转基因植物，或者采用基因编辑等先进技术，实现对植物基因表达的精确调控。

9、6)技术成本高：植物基因工程技术的研究和应用成本较高，这在一定程度上限制了其在广泛的作物品种改良中的应用。降低技术成本，使之更加普及和实用，是植物基因工程技术发展的一个重要方向。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种茶树纤维素合成酶基因启动子、克隆方法及其应用，尤其涉及一种茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p及其在调控下游基因表达以及制备转基因植物中的应用。

2、本发明是这样实现的，一种茶树纤维素合成酶基因启动子的克隆方法，茶树纤维素合成酶基因启动子的克隆方法包括：根据genbank中收录的茶树纤维素合成酶cesa4和cesa7的基因序列，分别设计特异性pcr(聚合酶链式反应)扩增引物；采用pcr方法克隆得到茶树纤维素合成酶基因cesa4和cesa7的启动子序列，扩增片段长度分别为1500bp、1497bp，并分别命名为启动子cesa4p、cesa7p。

3、进一步，茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p的核苷酸序列为seq id no:1，茶树纤维素合成酶基因启动子cesa7p的核苷酸序列为seq id no:2。

4、进一步，用于扩增茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p的特异性pcr引物对包括cesa4p-f、cesa4p-r，cesa7p-f、cesa7p-r；

5、其中，特异性pcr引物cesa4p-f的核苷酸序列为seq id no:3，引物cesa4p-r的核苷酸序列为seq id no:4，引物cesa7p-f的核苷酸序列为seq id no:5，引物cesa7p-r的核苷酸序列为seq id no:6。

6、进一步，茶树纤维素合成酶基因启动子的克隆方法包括以下步骤：

7、步骤一，以‘云茶1号’茶树品种全基因组dna为模板，利用pcr方法克隆得到茶树纤维素合成酶基因cesa4和cesa7的启动子序列cesa4p、cesa7p；

8、步骤二，利用gateway技术构建重组植物表达载体pbi101-cesa4p、pbi101-cesa7p；

9、步骤三，采用农杆菌介导的烟草遗传转化，以表达gus基因的方式进行茶树纤维素合成酶基因启动子的活性功能验证。

10、本发明的另一目的在于提供一种实施所述的茶树纤维素合成酶基因启动子的克隆方法得到的茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p。

11、本发明的另一目的在于提供一种表达盒和/或载体，表达盒和/或载体包含所述的茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p。

12、本发明的另一目的在于提供一种工程菌和/或转基因细胞系，工程菌和/或转基因细胞系包含所述的表达盒和/或载体。

13、本发明的另一目的在于提供一种所述的茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p在调控下游基因表达中的应用，下游基因包括gus。

14、本发明的另一目的在于提供一种所述的茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p在制备转基因植物中的应用，利用茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p制备转基因植物的方法包括：

15、利用ta克隆和双酶切技术分别将启动子cesa4p、cesa7p依次构建至克隆载体和目的载体，通过农杆菌介导的遗传转化法制备转基因植物。

16、进一步，转基因植物为双子叶植物或单子叶植物，优选为烟草；克隆载体和目的载体分别为pmd18-t和pbi101.3-gus plus。

17、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

18、第一，本发明提供了茶树纤维素合成酶基因启动子cesa4p、cesa7p及其在制备转基因植物中的应用。本发明以茶树品种‘云茶1号’的全基因组dna为模板，用pcr方法克隆得到茶树纤维素合成酶基因cesa4和cesa7的启动子序列，分别命名为cesa4p、cesa7p，然后利用gateway技术构建重组植物表达载体pbi101-cesa4p、pbi101-cesa7p，采用农杆菌介导的烟草遗传转化，以表达gus基因的方式进行启动子活性功能验证。本发明首次从茶树中克隆出特异性纤维素合成酶基因cesa4和cesa7的启动子序列，并验证了它们的活性，对于揭示茶树纤维素合成的机理，生物调控茶树纤维素的含量具有重要意义。

19、第二，本发明首次从茶树中克隆得到两种特异性纤维素合成酶基因启动子，并将其构建到植物表达载体中，在转基因植物中验证了该启动子的活性，对于揭示茶树纤维素合成的机理，以及生物调控茶树纤维素的含量等具有重要意义。

20、第三，本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：发明人通过对叶用经济作物茶树的研究，发现本发明所述的茶树纤维素合成酶基因启动子。所述两个启动子均具有活性，可用于各种对茶树纤维素的含量进行基因工程改造的应用，从而提升茶叶的经济价值。