一种NHS活性酯改性聚柠檬酸酯及其制备方法和应用

本发明属于组织胶黏剂，涉及一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯及其制备方法和应用。

背景技术：

1、人体组织伤口和缺损的闭合方式直接影响到其结构与功能的恢复，传统的伤口闭合主要采用缝合、夹合、钉合等机械闭合方式，但存在因漏液、漏气引起病发症、部分位置操作困难、术后拆除、手术操作繁琐耗时等问题。而组织胶黏剂由于使用方便，在手术伤口闭合、止血、组织密封、阻隔微生物、术后防粘连、植入物固定等领域具有广泛应用。目前，已应用于临床的组织胶黏剂主要包括纤维蛋白胶、α-氰基丙烯酸酯胶、peg胶、聚氨酯胶等类型，它们在密封、止血以及辅助机械闭合时的防漏等方面的临床应用取得了一定效果，但它们或因安全问题只能用于皮肤表面，或因湿态粘接强度低不能用于有张力的组织接合，应用受到很大限制。因此，开发生物相容的、具有高的湿粘接强度的组织胶黏剂以代替传统的机械闭合方式，具有广阔的临床应用前景。

2、柠檬酸与二醇单体在无催化剂条件下通过熔融缩聚可制得黏稠状的聚柠檬酸酯，由于其大分子上富含羟基和羧基，一方面通过热交联可形成一种网络型生物弹性体，具有良好的柔韧性和变形能力，生物学评价良好，力学性能可调且与组织相匹配，是一种非常有潜力的组织修复材料；另一方面，其对皮肤等软组织表现出较强的黏附能力，有文献报道(doi 10.1007/s10856-015-5649-2)通过一步熔融缩聚引入儿茶酚基团可形成聚柠檬酸酯基贻贝仿生软组织胶黏剂，其具有较高的组织粘接强度，应用潜力极大，但使用时需要使用高碘酸钠等强氧化剂促进胶黏剂的固化和粘结，氧化剂的存在会产生细胞毒性，进而影响胶黏剂在体内的应用安全性。而且，粘接强度高的此类胶黏剂一般疏水性较强，只能溶解于有机溶剂中使用，也影响了其人体使用的安全性。

3、因此，开发一种无需氧化剂，使用方便，且具有水溶性和湿态粘接强度高的新型聚柠檬酸酯基组织胶黏剂，具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯及其制备方法和应用；

2、为达到上述目的，本发明采用的方案如下：

3、一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯，主链包括柠檬酸单元与1,8-辛二醇单元，侧基接枝有nhs活性酯基团；

4、柠檬酸单元与1,8-辛二醇单元的摩尔比值为1.0～2.5；nhs活性酯基团的接枝率为5～30wt％。

5、作为优选的技术方案：

6、如上所述的一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯，主链还包括聚乙二醇(peo)单元或泊洛沙姆单元；

7、peo单元或泊洛沙姆单元与1,8-辛二醇单元的摩尔比值不大于2.3，peo单元或泊洛沙姆单元可用于调节分子结构的亲疏水性。

8、如上所述的一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯，nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的酸解离常数(pka)为2～3；nhs活性酯改性聚柠檬酸酯在ph为3～7的水(用碱调节体系的ph至3～7)中能够完全溶解，这是因为当用碱调节体系的ph至3～7时，所含羧基发生脱质子化，使nhs活性酯改性聚柠檬酸酯在水中实现完全溶解。

9、本发明所要解决的技术问题之一是提供一种用于人体组织表面黏附的改性聚柠檬酸酯。nhs活性酯反应活性高，常温、无催化剂的条件下即可与氨基反应。所以nhs活性酯改性聚柠檬酸酯在人体组织表面可通过与蛋白质的氨基发成化学键合而具有组织黏附性；此外，还可以利用含双氨基或多氨基的化合物作为交联剂，使线性的nhs活性酯改性聚柠檬酸酯之间发生交联而形成稳定的三维网状结构，从而提高nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的机械性能。聚柠檬酸酯一般只溶解在乙醇、丙酮、二氧六环等有机溶剂中，不能完全溶解在水中，在水中易发生相分离。然而，制备水溶性的聚柠檬酸酯在生物医用领域具有重要意义。文献上一般通过将水溶性良好的二元醇，如peo或泊洛沙姆单元引入到结构中可实现其在水中的溶解。但这种提高水溶性的方法，一方面增加了制备过程的复杂性，另一方面只有引入的亲水单元与1,8-辛二醇单元的摩尔比超过7/3时才能实现在水中的溶解，而大量亲水单元的引入使聚柠檬酸酯结构发生变化，特别是湿环境使用时溶胀度增大、力学性能降低。本发明经过大量实验探究，创造性地发现，不需要改变聚柠檬酸酯的化学结构，仅通过调节水体系的ph值就可将相分离的聚柠檬酸酯转变为均匀透明的聚柠檬酸酸酯水溶液，经分析，这是由于聚柠檬酸酯的化学结构中含有羧基，在偏酸性条件下，羧基是质子化的，分子链间通过疏水作用相互吸引，宏观上表现为与水发生相分离；但随着ph值的提高，羧基脱质子而带负电荷，从而使聚柠檬酸酯分子链之间产生静电斥力，分子链舒展，宏观上表现为完全溶解。

10、本发明还提供一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的制备方法，包括如下步骤：

11、(1)柠檬酸与1,8-辛二醇，或者进一步地柠檬酸、1,8-辛二醇与聚乙二醇(peo)或泊洛沙姆(peo-ppo-peo)通过熔融缩聚反应制备得到聚柠檬酸酯；

12、柠檬酸的羧基与其余反应原料的羟基的摩尔比为1.5～3.75:1；

13、当反应原料包括聚乙二醇或泊洛沙姆时，1,8-辛二醇与聚乙二醇或泊洛沙姆的摩尔比为0.3～1:1；

14、(2)聚柠檬酸酯与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，在脱水剂n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)存在的条件下，在丙酮溶剂中进行反应，丙酮溶剂的用量无特别要求，确保反应物溶解完全即可，反应结束后依次采用过滤、冰乙醚沉淀、丙酮溶解的方法进行提纯，制得nhs活性酯改性聚柠檬酸酯。

15、本发明所要解决的技术问题之二是提供一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的制备和提纯方法。

16、聚柠檬酸酯是由柠檬酸(含3个羧基和1个羟基)和二元醇(含2个羟基)通过熔融缩聚反应制备得到的聚酯，通过控制柠檬酸和二元醇的投料比，即羧基与羟基的比，在羧基过量的情况下使反应活性较高的二元醇羟基优先反应，柠檬酸中反应活性不高的羟基再缓慢参与缩聚反应，消耗羟基，再结合控制反应时间以调控羧基含量，最终可获得羧基数目一定且不含活泼羟基的聚柠檬酸酯。

17、确定羧基含量的聚柠檬酸酯与n-羟基丁二酰亚胺(nhs)，在脱水剂n,n-二环己基碳二亚胺(dcc)的存在下，通过聚柠檬酸酯上的羧基和nhs上的羟基发生酯化反应，从而将nhs活性酯基团接枝到聚柠檬酸酯分子的侧基上。通过控制羧基的含量与加入的nhs的比例，可调控接枝到柠檬酸酯上的nhs活性酯侧基的含量。

18、反应物(聚柠檬酸酯和nhs)在脱水剂dcc的作用下发生偶联反应生成产物(nhs活性酯改性聚柠檬酸酯)，但反应结束后反应体系包括两种反应物、脱水剂、产物，另外还生成了副产物，所以需要进行提纯。实验探索发现，副产物不溶于丙酮，可通过过滤除去；反应物、脱水剂、产物都溶解在丙酮中；产物不能溶解在冰乙醚中，而未反应的单体和脱水剂则可溶解于冰乙醚中，所以利用产物在冰乙醚与丙酮中溶解度的不同，本发明采用过滤、冰乙醚沉淀、丙酮溶解的方法提纯产物，600m核磁共振氢谱中没有反应物和副产物的峰。

19、作为优选的技术方案：

20、如上所述的一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的制备方法，步骤(1)中熔融温度为160℃，缩聚的反应温度为140℃，缩聚反应时间为1～10h；

21、步骤(2)中反应温度为10～40℃，反应时间为6～24h；

22、步骤(2)中n-羟基丁二酰亚胺与n,n-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1，n-羟基丁二酰亚胺与聚柠檬酸酯羧基的摩尔比值为0.1～1.5。

23、本发明还提供一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的应用，以nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的水溶液作为a组分，含有多氨基的天然分子的水溶液作为b组分，a组分与b组分混合而原位形成水凝胶胶黏剂；b组分中的氨基与a组分中nhs基团的摩尔比值为0.2～0.8；

24、含有多氨基的天然分子为聚赖氨酸、胱氨酸、壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、明胶、胶原蛋白或丝蛋白；

25、按照yyt0729.1-2009测试的水凝胶胶黏剂的搭接-剪切粘接强度为20～100kpa。

26、本发明所要解决的技术问题之三是提供一类双组份合成软组织胶黏剂，该水凝胶胶黏剂属于水性胶范畴，使用的材料安全，具有原位可注射性，粘接性能优良，按照yyt0729.1-2009测试的水凝胶胶黏剂的搭接-剪切粘接强度为20～100kpa，优于目前商用的纤维蛋白胶。水凝胶胶黏剂的粘接机理：一方面，a组分中的nhs活性酯基团与b组分中的氨基通过化学反应形成稳定的酰胺键，使水凝胶胶黏剂的本体发生交联而固化；另一方面，a组分中的nhs活性酯基团与被粘物(组织)表面的氨基通过化学反应形成稳定的酰胺键，使水凝胶胶黏剂在界面产生黏附能力。水凝胶胶黏剂的本体交联固化和界面黏附过程同时进行。

27、作为优选的技术方案：

28、如上所述的一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的应用，水凝胶胶黏剂的具体制备步骤如下：

29、(1)将nhs活性酯改性聚柠檬酸酯加入到去离子水中，调节水溶液的ph＝3～7后进行溶解，得到浓度为10～50wt％的nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的水溶液；

30、(2)将含有多氨基的天然分子溶解于去离子水中，得到浓度为10～50wt％的含有多氨基的天然分子的水溶液；

31、(3)nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的水溶液与含有多氨基的天然分子的水溶液在被黏物表面混合，反应形成水凝胶胶黏剂。

32、本发明还提供一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的应用，nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的水溶液与丹宁酸(ta)水溶液混合而形成湿态的凝聚体胶黏剂；nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的水溶液是将nhs活性酯改性聚柠檬酸酯加入到去离子水中，调节水溶液的ph＝3～7后进行溶解得到的，nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的水溶液的浓度为10～50wt％；丹宁酸水溶液的浓度为10～30wt％；nhs活性酯改性聚柠檬酸酯与丹宁酸的质量比值为0.25～4。

33、本发明所要解决的技术问题之四是提供一类单组份的合成软组织胶黏剂，该凝聚体胶黏剂制备方法简单，引入的丹宁酸组份使其具备了抗氧化、抗菌性能，结构中的动态氢键使其具有自愈合性。其中，湿态的凝聚体胶黏剂还具有可注射性；干态的凝聚体胶黏剂有利于存储，使用便捷。

34、湿态的凝聚体胶黏剂可直接注射于组织缺损处起到粘接或密封作用；干态的凝聚体胶黏剂可喷涂于组织缺损表面，吸收表面水层的水而恢复为湿态的凝聚体胶黏剂，并产生粘接或密封作用。

35、干态的凝聚体胶黏剂的粘接机理为：一方面，吸收表面水后恢复了本体内聚力；另一方面，凝聚体胶黏剂中的nhs活性酯基团与组织表面的氨基通过化学反应形成稳定的酰胺键，在界面产生黏附力，并通过丹宁酸与组织表面形成的氢键作用和疏水作用进一步增强黏附力。

36、nhs活性酯改性聚柠檬酸酯与ta通过氢键作用、疏水作用形成凝聚体胶凝剂，水在该体系中起到重要作用，包括增塑和参与形成氢键。不同于nhs活性酯改性聚柠檬酸酯，凝聚体胶黏剂脱水干燥后呈固态，而nhs活性酯改性聚柠檬酸酯干燥后仍呈黏稠的液态。也就是说，ta作为交联剂使nhs活性酯改性聚柠檬酸酯发生了交联，形成了网络结构，内聚力增强；ta含量越高，网络越密，刚性越高，但性能反而变脆，所以干燥后的凝胶体性脆，可机械破碎为细粉状。但当细粉状凝聚体胶黏剂吸水后，水作为增塑剂以及氢键供体，促使凝聚体发生自愈合，重新恢复内聚力，并产生粘接功能。

37、作为优选的技术方案：

38、如上所述的一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的应用，湿态的凝聚体胶黏剂依次经过真空冷冻干燥或真空干燥、机械粉碎后形成干态的凝聚体胶黏剂；进一步地，干态的凝聚体胶黏剂溶解于易挥发有机溶剂中后涂覆于载体上，干燥后形成自黏性贴片；

39、机械粉碎的方法为球磨法或低温(-196～0℃)粉碎法；

40、按照yyt0729.2-2009测试的自黏性贴片的t型粘接强度≥1n/cm；

41、干态的凝聚体胶黏剂溶解于易挥发有机溶剂中得到的溶液浓度为10～50wt％；

42、易挥发有机溶剂为甲醇、丙酮、二氧六环或四氢呋喃；

43、涂覆方法为旋涂、浸涂或喷涂；

44、干燥温度为25～80℃。

45、如上所述的一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的应用，将湿态的凝聚体胶黏剂溶于有机溶剂中，控制浓度为10～50wt％，喷雾干燥得到干态的凝聚体胶黏剂；

46、有机溶剂为甲醇、丙酮、二氧六环、四氢呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。

47、本发明所要解决的技术问题之五是提供一种医用自黏性贴片，该贴片使用方便，粘接和封堵性能良好，根据yyt0729.2-2009测试的t型粘接强度≥1n/cm，优于市售纤维蛋白胶，与目前报道的最强液体绷带相近。

48、自黏性贴片粘接机理为：一方面，当贴片与湿的组织表面接触时，胶黏剂层因吸水而恢复本体内聚力；另一方面，胶黏剂层中的nhs活性酯基团与组织表面的氨基通过化学反应形成稳定的酰胺键，在界面产生黏附力，并通过丹宁酸与组织表面形成的氢键作用和疏水作用进一步增强黏附力；第三，利用载体的机械承载力进一步提高粘接强度。

49、有益效果

50、(1)本发明的一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯呈线性结构，通过调节溶液ph，可以溶解在水中，使用安全；

51、(2)本发明一种nhs活性酯改性聚柠檬酸酯制备过程中，nhs活性酯改性聚柠檬酸酯的nhs活性酯基团的含量可以通过熔融缩聚中控制羧基含量和偶联反应中控制n-羟基丁二酰亚胺的用量来控制；

52、(3)本发明的nhs活性酯改性聚柠檬酸酯应用时，nhs活性酯改性聚柠檬酸酯、含有多氨基的天然分子或者丹宁酸，分别都溶解于水中，安全无毒；

53、(4)本发明的nhs活性酯改性聚柠檬酸酯应用时，不需要加入氧化剂即可完成粘接过程；

54、(5)本发明应用中制得的干态凝聚体胶黏剂易存储，可直接喷涂伤口，使用便捷；

55、(6)本发明应用中制得的干态凝聚体胶黏剂吸附组织表面水而促进与组织表面的紧密接触，同时利用吸附的水而恢复本体内聚力，并促进与组织表面的化学键合，无需外加物质，安全高效；

56、(7)本发明应用中制得的干态凝聚体胶黏剂可以制备成贴片使用，利用载体的较高的承载能力，提高了胶黏剂的粘接强度和封堵效果。