一种防治代谢相关脂肪性肝病的螺旋藻益生菌发酵组合物、制备方法与应用

本发明属于微生物发酵技术应用领域，具体为一种防治代谢相关脂肪性肝病的螺旋藻益生菌发酵组合物，特别的还涉及该组合物的制备方法和应用。

背景技术：

1、随着城市化、现代化程度不断提高，居民生活方式和饮食结构发生很大改变，无论是在西方国家，还是在亚洲国家，脂肪肝的患病率都日益攀升，并成为全球越来越普遍的重要公共健康问题。其中，代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liverdisease,mafld)作为全球最为常见的肝病，与2型糖尿病、高血脂症、肥胖等代谢类疾病密切相关，备受人们关注。根据相关数据统计，mafld的全球患病率已突破25％，其中亚洲地区的患病率约为27％左右，且发病率日益增加。mafld合并2型糖尿病、高脂血症、高血压时的肝癌发生风险会成倍增加，严重影响着患者的生活质量。

2、mafld已成为严重的公共卫生危机，对医疗卫生体系形成了严峻挑战。迄今为止，还未批准任何治疗mafld的特效药物，而膳食营养调控成为防治脂肪肝的有效途径之一。

3、螺旋藻富含高质量的蛋白质、γ-亚麻酸的脂肪酸、类胡萝卜素、维生素，以及多种微量元素如铁、碘、硒、锌等。研究表明，螺旋藻具有降脂、抗氧化等诸多生理功能，但是腥味较重严重影响了其产品开发。益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，且能够将螺旋藻的原有物质成分通过生物转化代谢成其他成分，然而由于菌株特异性导致不同益生菌发酵螺旋藻的有益效果存在着一定程度上的差距。因此，筛选适合螺旋藻发酵的菌株/组合很有必要。

4、我们在前期研究中发现通过植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌、凝结芽孢杆菌中的一种，或与酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母复合发酵能够显著提高螺旋藻蛋白和氨基酸的含量，增强其抗氧化活性(cn 114698714 a)，但是更加适宜螺旋藻发酵的相关菌株/组合仍不确定，其防治代谢相关脂肪性肝病的效果也不明确。现有技术中，有涉及到将含有螺旋藻的发酵混合物后用于预防草鱼脂肪肝中的，但其组分中涉及多种中药成分，主要以茵陈和辣蓼草为主，螺旋藻占比较少，很难评估其在预防草鱼脂肪肝中的作用效力。

5、目前还未见以螺旋藻为主的发酵物应用在防治代谢相关脂肪性肝病上的报道和应用，基于此，进行了以下发明。

技术实现思路

1、本发明属于微生物发酵技术应用领域，具体为一种防治代谢相关脂肪性肝病的螺旋藻益生菌发酵组合物、制备方法与应用。

2、本发明所提供的螺旋藻益生菌发酵组合物具体是通过特定益生菌组合来发酵螺旋藻实现的，发酵后获得的组合物总黄酮和总酚含量，得到显著的提高，抗氧化活性增强，在动物试验中能够显著改善高脂饮食诱导的肝组织代谢紊乱，有效防治代谢相关脂肪性肝病，同时还能有效克服螺旋藻本身的腥味，提高螺旋藻食品的风味品质。

3、本发明具体的技术方案如下：

4、一种防治代谢相关脂肪性肝病的螺旋藻益生菌发酵组合物，所述的益生菌为嗜酸乳杆菌、马克思克鲁维酵母；所述发酵组合物是由嗜酸乳杆菌、马克思克鲁维酵母组合发酵螺旋藻后制备获得的。

5、其中，嗜酸乳杆菌于2016年8月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，分类命名：嗜酸乳杆菌kdb-03(lactobacillus acidophiluskdb-03)，保藏编号：cctcc no：m 2016429。

6、特别的，本发明所要重点保护的范围还包括经该嗜酸乳杆菌、马克思克鲁维酵母组合发酵后的螺旋藻在制备防治代谢相关脂肪性肝病功效产品，以及改善含有螺旋藻食品风味中的应用。

7、一种防治代谢相关脂肪性肝病的螺旋藻益生菌发酵组合物，其制备方法包括如下步骤：

8、(1)螺旋藻发酵基质的制备：取鲜/干螺旋藻配制发酵基质，基质配方组分包括鲜/干螺旋藻、碳源(葡萄糖或蔗糖等糖类化合物)、氮源(蛋白胨或酵母粉等)，经超高温瞬时蒸汽灭菌管道进入发酵罐，得到螺旋藻发酵基质；

9、(2)发酵种子液的制备：将乳酸菌和酵母菌分别涂布于mrs/ypd固体板进行活化；活化结束后分别挑取单菌落至mrs/ypd液体培养基中进行培养，继代两次后放大培养，20-30h后将培养液离心去上清，然后用磷酸缓冲液冲洗菌体后重悬，分别获得乳酸菌和酵母菌的母浓缩种子液。

10、在该步骤的预试验中，本发明人采用了多种供试菌种，包括：植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌(普通市售)、本发明中经特殊保藏的嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌等乳酸菌菌种以及酿酒酵母、马克思克鲁维酵母等酵母菌。

11、结果显示，发酵可显著提高螺旋藻的功能成分和抗氧化能力，其中单菌发酵以本发明中经特殊保藏的嗜酸乳杆菌效果最好，其次是酿酒酵母；双菌发酵中以本发明中经特殊保藏的嗜酸乳杆菌与马克思克鲁维酵母两者组合发酵螺旋藻的效果最好，并且效果十分显著，其中总黄酮和总酚含量分别提高46.8％和65.7％，dpph自由基清除能力和铁还原能力分别提高75.2％和62.5％。

12、此外，经发酵工艺优化后获得的双菌发酵产物中氨基酸及其衍生物、有机酸的含量大幅增加，脂类、核苷酸及其衍生物的组成也发生了较大变化，相比高脂对照组，螺旋藻发酵产物处理组小鼠的体重增幅下降10.4％左右，肝组织重量下降18.5％左右，肝组织的形态和代谢图谱趋向于正常对照水平，机体代谢水平也更加活跃，在缓解高脂饮食导致的脂肪肝中表现突出。

13、特别的，本发明筛选的双菌组合通过发酵还能够大大改善螺旋藻腥味，进一步了提高产品的风味品质。

14、(3)将步骤(2)的两种浓缩种子液接种到发酵基质中进行复合发酵培养，获得螺旋藻发酵产物。

15、优选的，步骤(1)基质配方中，以质量百分比计，螺旋藻干物质含量0.5-4％、碳源含量为0.5％-5％、氮源含量为0.1-5％，超高温瞬时灭菌温度115℃-150℃，灭菌时间3-8s，物料泵入速度为5-20l/min。

16、优选的，步骤(2)中，在mrs/ypd固体板中活化条件为：30-37℃培养24-48h进行活化；菌落在mrs/ypd液体培养基中培养条件为：30-37℃培养24-48h。

17、优选的，步骤(3)中，浓缩液接种量为0.1-6.0％，v/v，添加配比：嗜酸乳杆菌浓缩种子液：马克思克鲁维酵母浓缩种子液＝1-3：1-3。

18、优选的，步骤(3)中，复合发酵培养条件：发酵温度28-36℃，发酵时间24-48h。

19、通过上述方法制备获得的螺旋藻益生菌发酵组合物能够应用在制备防治代谢相关脂肪性肝病功效产品中。

20、通过上述方法制备获得的螺旋藻益生菌发酵组合物还能够应用在改善含有螺旋藻食品风味中。

21、上述的产品可以为食品、保健品或药品中的任一种；产品可以是固体或液体或悬浊液、乳浊液产品或其它形式的产品，产品形式不限，比如产品为固体饮料、液体饮料中的任一种。

22、本发明的有益效果在于：

23、1.利用瞬时蒸汽灭菌能最大程度地保留螺旋藻的原有品质，利用筛选的嗜酸乳杆菌和马克思克鲁维酵母组合发酵又显著提高了螺旋藻中的总黄酮和总酚含量以及抗氧化活性，相比未发酵，总黄酮和总酚含量分别提高46.8％和65.7％，dpph自由基清除能力和铁还原能力分别提高75.2％和62.5％；相比其他组合发酵，总黄酮含量高14.2-31.1％，总酚含量高22.5-66.2％，dpph自由基清除能力高10.1-47.3％，frap含量提高1.0-20.8％；

24、2.本发明中的嗜酸乳杆菌和马克思克鲁维酵母组合发酵改善了螺旋藻的原有营养组分，从非靶代谢组lc-ms分析结果来看，发酵后氨基酸及其衍生物、有机酸的含量大幅增加，脂肪酸类、核苷酸及其衍生物的组成也发生了较大变化；其中，氨基酸及其衍生物和有机酸的含量提高20.42％和1.69％，长链多不饱和脂肪酸、核苷酸及其衍生物分别下降14.36％和0.71％；

25、3.服用本发明中保藏的嗜酸乳杆菌与马克思克鲁维酵母组合发酵螺旋藻后可显著改善高脂饮食诱导的脂肪肝小鼠的各项机体指标；相比高脂对照组，螺旋藻发酵产物处理组小鼠的体重增幅下降10.4％左右，肝组织重量下降18.5％左右，肝组织形态及肝组织代谢产物中的氨基酸、胆汁酸、脂肪酸及有机酸等代谢物趋于趋向于正常对照水平，机体代谢水平也更加活跃，在缓解高脂饮食导致的脂肪肝中表现突出，在代谢相关脂肪性肝病上具有很好的应用效果；

26、4.本发明中筛选的嗜酸乳杆菌与马克思克鲁维酵母组合发酵改善了螺旋藻的原有风味，从气相离子色谱gc-ims的检测结果来看，发酵前后风味物质图谱发生较大变化，发酵后主要挥发性风味物质的信号强度显著下降，其中醛类等具有腥味刺激性味道的物质占比显著降低，有效除去了螺旋藻本身的腥味；酮类、醇类和呋喃类等物质的占比显著增加，赋予了螺旋藻特有的发酵风味；从感官评价来看，二者组合发酵达到了其它菌种发酵时所达不到的技术效果。