一种定点突变的蔗糖磷酸化酶及其应用

本发明属于基因工程和蛋白质工程，涉及一种定点突变的蔗糖磷酸化酶及其应用。

背景技术：

1、l-抗坏血酸(l-ascorbic acid,laa)又称维生素c，是人体必需的维生素和天然抗氧化剂，具有保护作用的抗氧化剂，在维持人体健康中承担重要的角色。但是，laa的高抗氧化活性限制了其重要的应用，例如在化妆品和食品中，需要laa的持久效果。2-o-alpha-d-吡喃葡萄糖基-l-抗坏血酸(2-o-alpha-d-glucopyranosyl-l-ascorbic acid,aa-2g)，在稳定性和人类的生物利用度之间提供了一个实际的妥协，因为它可以被上皮组织中广泛存在的α-葡萄糖苷酶缓慢水解，释放出laa发挥生理作用。aa-2g已经是一种工业化生产的精细化学品，在皮肤护理化妆品中具有既定的用途，其另一个重要用途是作为药品、食品中的laa补充剂。

2、蔗糖磷酸化酶(ec 2.4.1.7,spase)是糖苷水解家族gh13(gh13_18)亚家族18的成员，可催化蔗糖可逆磷酸化为α-d-葡萄糖-1-磷酸和果糖。spase也是一种公认的转糖苷酶，广泛用于合成多种糖苷，其中一个重要应用是该酶可以以蔗糖为糖基供体高效催化l aa糖基化一步法直接生成aa 2g。虽然spase具有较好的工业应用前景，但其产率低。因此，需要进行天然spase的基因修饰，实现其催化效率的提高。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种定点突变的蔗糖磷酸化酶，所提供的变体酶催化效率明显提高，从而可以提高l-抗坏血酸葡萄糖苷的产率，降低生产成本，解决了现有技术中蔗糖磷酸化酶部分受体特异性低、酶活低的问题，具有广阔的工业应用前景。

2、本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶，由氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶(bispase)中制造点突变获得，所述点突变的突变位点是选自：第141位和/或第197位。

3、优选地，其所述第141位的点突变为苏氨酸突变为半胱氨酸。

4、优选地，所述第197位的点突变为甘氨酸突变为半胱氨酸。

5、本发明的第二个目的是提供一种dna分子，其编码本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶。

6、根据本发明所述的dna分子的进一步特征，所述dna编码的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列是选自：seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4所示的氨基酸序列。

7、具体来说，seq id no.2中，第141位的苏氨酸突变为半胱氨酸。seq id no.3中，第197位的甘氨酸突变为半胱氨酸。seq id no.4中，第141位的苏氨酸突变为半胱氨酸，同时第197位的甘氨酸突变为半胱氨酸。

8、本发明的第三个目的是提供一种载体，其含有本发明所述的dna分子。

9、本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，其含有本发明所述的dna分子，或者含有本发明所述的载体。

10、本发明的第五个目的是提供一种本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶的生产方法。

11、本发明所述的生产方法包括：在适于蔗糖磷酸化酶表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的蔗糖磷酸化酶。

12、本发明的第六个目的是提供本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶在制备l-抗坏血酸葡萄糖苷中的应用。

13、本申请所述的蔗糖磷酸化酶突变体是在长双歧杆菌来源的蔗糖磷酸化酶的基础上进行定点突变而获得的，提高了蔗糖磷酸化酶的酶活，有利于扩大蔗糖磷酸化酶转糖苷作用于工业化的应用前景，实现大规模工业化应用。

技术特征：

1.一种定点突变的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，由氨基酸序列如seq id no.1所示的蔗糖磷酸化酶(bispase)中制造点突变获得，所述点突变的突变位点是选自：第141位和/或第197位。

2.根据权利要求1所述定点突变的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述第141位的点突变为苏氨酸突变为半胱氨酸。

3.根据权利要求1所述定点突变的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，所述第197位的点突变为甘氨酸突变为半胱氨酸。

4.一种dna分子，其特征在于：其编码权利要求1所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶。

5.根据权利要求4所述的dna分子，其特征在于：其编码的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列是选自：seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4所示的氨基酸序列。

6.一种载体，其特征在于：其含有权利要求4或5所述的dna分子。

7.一种宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求4或5所述的dna分子，或者含有权利要求6所述的载体。

8.一种如权利要求1所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶的生产方法，其特征在于，所述方法包括：在适于蔗糖磷酸化酶表达的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，并从培养基中分离所述的蔗糖磷酸化酶。

9.如权利要求1所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶在制备l-抗坏血酸葡萄糖苷中的应用。

技术总结
本发明属于基因工程和蛋白质工程技术领域，涉及一种定点突变的蔗糖磷酸化酶及其应用。本发明所述的定点突变的蔗糖磷酸化酶，由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蔗糖磷酸化酶(BiSPase)中制造点突变获得，所述点突变的突变位点是选自：第141位和/或第197位。优选地，其所述第141位的点突变为苏氨酸突变为半胱氨酸；所述第197位的点突变为甘氨酸突变为半胱氨酸。本发明所提供的蔗糖磷酸化酶变体酶的催化效率明显提高，从而可以提高L‑抗坏血酸葡萄糖苷的产率，降低生产成本，解决了现有技术中蔗糖磷酸化酶部分受体特异性低、酶活低的问题，具有广阔的工业应用前景。

技术研发人员：姚冬生,郑少燕,周伟杰,陈雪,谢春芳
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15