转基因作物目的基因GAT-MS拷贝数检测方法及试剂盒与流程

本发明涉及基因检测，尤其涉及一种转基因作物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒。

背景技术：

1、随着分子生物技术快速发展，特别是转基因技术的出现，给植物育种带来新的技术手段。目前转基因技术有基因枪转化法、农杆菌介导转化法等。其中转基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此，检测转入目标基因的拷贝数是转基因研究中关键的一步。

2、目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：比较基因组杂交技术(comparativegenome hybridization,cgh)、taqman荧光探针技术、变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography,dhplc)技术、多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,mlpa)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛，但其缺陷依旧明显：cgh技术分辨率在mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出，同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板dna，不利于大范围的推广；taqman荧光探针合成原料成本高、获取难度大，且通常无法克服信噪比低的缺陷，实验数据可重复性差；dhplc技术在实践应用中，分辨力常受到实验设计、检测环境等因素的影响，存在可靠性和稳定性欠佳的问题；mlpa技术操作复杂，且需要毛细管电泳进行产物分析，整个实验耗时过长；新一代测序技术适合大样本的检测，但其依托的测序平台价格昂贵，且需要专业实验操作和数据分析人员，不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。

3、实时荧光定量pcr技术(quantitative real-time pcr，qpcr)是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定dna序列进行定量分析的方法。常规qpcr用于拷贝数分析时，需要至少两对引物，一对引物用于扩增目的基因，一对引物用于扩增内参基因(一般选取基因组中的单拷贝基因)，通过扩增效率和ct值计算各自的表达量并转换成相对定量或绝对定量，最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数。该方法最常见的问题有：两对引物扩增效率不一致；每次实验都需检测扩增效率或固定扩增效率但批次之间会有差异；目的基因检测与内参基因检测在不同样品孔中，不同反应体系中操作中的微小差异容易导致定量变化。由于qpcr的灵敏度较高，上述微小差异最终可能导致计算所得的定量值偏离实际较远，故常规qpcr在鉴定拷贝数时存在较大的误差。

技术实现思路

1、有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种转基因作物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒。所述方法首次利用实时荧光定量pcr熔解曲线法进行转基因作物目的基因拷贝数的检测。具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种转基因作物目的基因拷贝数检测方法，所述转基因作物目的基因为gat-ms，其核苷酸序列如seq id no.1所示；基于gat-ms与内源基因包含的相同或相似序列，设计共用引物对；然后使用所述共用引物对，以待测转基因作物样品的基因组dna为模板，经qpcr，得pcr产物；分析所述pcr产物的熔解曲线，根据gat-ms熔解峰和内源基因熔解峰的荧光强度比值，判定转基因作物目的基因拷贝数；所述gat-ms熔解峰和内源基因熔解峰对应的温度差值≥1.0℃。

4、在本发明中，所述转基因作物目的基因为gat-ms。gat-ms为水稻来源的花粉育性恢复基因oscyp704b2的cds序列，无内含子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、在本发明中，所述内源基因是指在转基因作物及野生型作物中同gat-ms具有相同或相似功能的基因。所述内源基因不仅限于gat-ms改造来源的基因，还可以选择与gat-ms改造来源基因相似性较高的其他基因。

6、由于gat-ms的序列中包含与内源基因部分序列相近似或者相同的区段，进而可基于该相同或相似序列设计得到共用引物对。

7、本发明以待测转基因作物样品的基因组dna为模板，若gat-ms在转基因作物中表达，则可利用gat-ms和内源基因的共用引物对，在同一qpcr反应体系中扩增得到两种大小不同、含量不同、gc比例不同的pcr产物。

8、本发明利用pcr产物的大小差异及gc比例差异，可在熔解曲线中呈现两个单一可区分的熔解峰；利用pcr产物的含量差异，可在熔解曲线中呈现不同的熔解峰荧光值。

9、本发明通过分析所述pcr产物的熔解曲线，根据gat-ms熔解峰和内源基因熔解峰的荧光强度比值，可准确定量转基因作物目的基因拷贝数。

10、gat-ms的序列与内源基因的序列存在差异，该差异程度能使gat-ms熔解峰和内源基因熔解峰对应的温度差值≥1.0℃，从而使两个熔解峰的区分更为方便容易。

11、进一步的，在本发明优选的实施方式中，所述内源基因可选择oscyp704b2，其核苷酸序列如seq id no.2所示。在本发明中，相较于其他内源基因和gat-ms的组合，oscyp704b2和gat-ms对应的熔解曲线峰线条清晰更易区分，无干扰峰，且重复性好。

12、进一步的，本发明所述共用引物对的设计原则优选包括：使内源基因与目的基因的扩增产物因gc含量的差异而在待测样品中呈现两个单一可区分的熔解峰。

13、优选的，所述共用引物对的上游引物在oscyp704b2基因的结合位置为第1外显子，所述共用引物对的下游引物在oscyp704b2基因的结合位置为第2外显子。基于第1和第2个外显子设计得到的特异性上下游检测引物对在gat-ms转基因作物的目的基因扩增中表现良好，其扩增产物间的区分性更为明显。

14、更优选的，所述共用引物对的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。此对引物在以待测的gat-ms转基因水稻样品为模板，扩增内源基因序列时，获得的片段长度为249bp；扩增gat-ms目的基因序列时，获得片段长度为161bp，二者存在88bp差异，且gc含量也存在明显差异。

15、优选的，本发明所述qpcr的反应体系以10μl计，包括0.5μl上游引物10μm，0.5μl下游引物10μm，5μl qcr master mix2x，0.1μl cxr 100x*，1μl模板dna 10±2ng，用ddh2o补足10μl。

16、优选的，本发明所述qpcr的反应程序为：50℃，1min；94-95℃，7min；94-95℃，10-20sec；60-62℃，1min，共计25个循环；60℃-95℃持续收集荧光信号，建立熔解曲线，获得的熔解曲线区分度更好。

17、进一步优选的，所述60℃-95℃持续收集荧光信号的程序为：60℃，1min；温度增量步进：0.2℃/sec至95℃，5sec；20℃，10sec。

18、优选的，在本发明中，熔解曲线的获取方法包括：把qpcr法扩增后的pcr产物缓慢升温至95℃，扩增产物双链dna随温度升高逐渐变性解链产生单链，解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来，利用仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线，并得到相应pcr产物的熔解曲线峰图。

19、进一步的，在本发明所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法中，转基因作物gat-ms拷贝数＝k×(gat-ms熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值)。其中，k为常数，且k的值优选根据内源基因在作物中的拷贝倍数确定。例如，当本发明所述转基因生物为水稻，且选取的内源基因为单拷贝的oscyp704b2时，由于转基因水稻为二倍体，故k值优选为1×2＝2。即，在以gat-ms转基因水稻为待测样品时，转基因水稻gat-ms拷贝数＝2×(gat-ms熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值)。

20、在本发明更为优选的实施方式中，还可采用如下标准对转基因作物(尤其是转基因水稻作物)的目的基因拷贝数进行判断：

21、若gat-ms熔解峰缺失，仅存在内源基因熔解峰，则所述转基因作物目的基因拷贝数为0；

22、若gat-ms熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值≥0.40，且≤0.69，则所述转基因作物目的基因拷贝数为1；

23、若gat-ms熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值≥0.82，且≤1.21，则所述转基因作物目的基因拷贝数为2；

24、若gat-ms熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值≥1.34，且≤1.67，则所述转基因作物目的基因拷贝数为3。

25、在进一步优选的实施方式中，所述转基因作物(尤其是转基因水稻作物)目的基因拷贝数检测方法的结果判断标准为：

26、若目的基因熔解峰缺失，仅存在内源基因熔解峰，则所述转基因作物目的基因拷贝数为0；

27、若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值≥0.51，且≤0.64，则所述转基因作物目的基因拷贝数为1；

28、若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值≥0.92，且≤1.11，则所述转基因作物目的基因拷贝数为2；

29、若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值≥1.41，且≤1.60，则所述转基因作物目的基因拷贝数为3。

30、上述判断方法得到的拷贝数检测结果准确性更高，重复性更好。

31、在本发明进一步提供的具体实施方式中，所述转基因作物为转基因水稻，其目的基因拷贝数检测方法以oscyp704b2作为内源基因，检测gat转基因水稻目的基因gat-ms的拷贝数，具体包括如下步骤：

32、(1)设计gat-ms与内源基因共同的上下游引物：根据水稻基因oscyp704b2以及gat-ms目的基因的序列特点，设计上下游引物；其中gat-ms目的基因来自oscyp704b2的cds序列，经过序列比对，在第一外显子与第二外显子上设计共同的上下游引物，使内源基因与目的基因扩增片段大小不同。

33、(2)提取野生型对照及待测转基因样本的基因组dna。

34、(3)配制反应体系：在反应体系中加入上游引物、下游引物、dna聚合酶，dntps以及pcr buffer，dna饱和性染料，后分别加入野生型基因组dna和待测转基因样本的基因组dna。

35、(4)进行pcr反应：将配制好的反应体系置于pcr仪进行pcr反应，实现基因扩增。

36、(5)分析熔解曲线并判定目的基因的拷贝数：根据熔解曲线中oscyp704b2基因和gat-ms目的基因pcr产物熔解峰的荧光强度比值，判定待测样本gat-ms目的基因的拷贝数。

37、进一步的，步骤(1)中上下游引物设计原则优选为，使内源基因与目的基因的扩增产物由于gc含量的差异而在待测样品中呈现可区分的两个单一的熔解峰。

38、更进一步的，上游引物选择：ms26-qf(23nt)：5’-ctcctacacctacattgccgacc-3’(seq id no.3)；下游引物选择ms26-qr(23nt)：5’-tcttcctttgcttcctccacatc-3’(seq idno.4)。

39、进一步的，步骤(3)中以单管反应体系10μl计，各个加入物的用量优选为：0.5μl上游引物10μm，0.5μl下游引物10μm，5μlqcr master mix 2x，0.1μl cxr 100x*，1μl模板dna 10±2ng，用ddh2o补足10μl。

40、进一步的，步骤(4)中pcr反应参数设置优选为：50℃，1min；94-95℃，7min；94-95℃，10-20sec，60-62℃，1min，共计25个循环；60℃-95℃持续收集荧光信号，建立熔解曲线，(60℃，1min，温度增量步进：0.2℃/sec至95℃，5sec)；20℃，10sec。

41、进一步的，步骤(3)所述dna饱和性染料优选包括但不局限于sybr green、evagreen、lcgreen@plus、resolight、syto9中的任意一种。

42、进一步的，步骤(5)优选根据下式判定待测样本目的基因的拷贝数：gat-ms拷贝数＝2×(gat-ms熔解峰荧光值/oscyp704b2熔解峰荧光值)。

43、若样本gat-ms熔解峰缺失，仅存在oscyp704b2熔解峰，则该样本的gat-ms目的基因拷贝数为0；若样本的gat-ms熔解峰荧光值/oscyp704b2熔解峰荧光值在0.40-0.69之间，则该样本的gat-ms目的基因拷贝数为1；若样本的gat-ms熔解峰荧光值/oscyp704b2熔解峰荧光值在0.82-1.21之间，则该样本的gat-ms目的基因拷贝数为2；若样本的gat-ms熔解峰荧光值/oscyp704b2熔解峰荧光值在1.34-1.67之间，则该样本的gat-ms目的基因拷贝数为3。

44、本发明建立了一种快速检测转基因作物中目的基因拷贝数的方法，该方法首次利用实时荧光定量pcr熔解曲线法进行转基因作物目的基因拷贝数检测，扩增产物双链dna随温度升高逐渐变性解链产生单链，解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来，仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线，并得到相应pcr产物的熔解曲线峰图，根据熔解曲线中目的基因和内源基因产物熔解峰的荧光强度比值，定量目的基因拷贝数。

45、本发明提供的转基因作物目的基因拷贝数检测方法在一个pcr反应体系中进行，读取单管pcr产物的数据，便可计算转基因植株中目的基因拷贝数；整个扩增和检测过程均为闭管操作，可避免污染和假阳性结果；使用一对引物扩增，其扩增效率完全相同，避免了不同管不同批次间的差异，与常规方法相比准确度大大提高；无需构建标准曲线、无需筛选严格的符合扩增效率的引物；扩增片段短，采用较高的退火温度，保证了扩增的特异性。

46、本发明提供的转基因作物目的基因拷贝数检测方法普适性广，成本低；不涉及荧光探针的酶切或链置换反应，因此所有适合pcr的dna聚合酶均适用于本体系，且无需添加其他特殊组分；同时适用于各种型号的荧光定量pcr平台。

47、本发明提供的转基因作物目的基因拷贝数检测方法操作简单，耗时短；无需样本特殊处理等步骤，整个操作流程仅需要1.5小时左右即可完成样本的分析。

48、本发明提供的转基因作物目的基因拷贝数检测方法，结果分析简单，实验数据可重复性好；对每个样本只需知道其熔解峰信号强度便可完成结果判定，无需参照标准品，可完全依靠仪器配套的软件同时分析大量样本。

49、综上，本发明提供的转基因作物目的基因拷贝数检测方法显著提高了转基因作物中目的基因拷贝数判断的准确性和特异性，且费用低廉，操作简单，耗时短。本发明为转基因作物中目的基因拷贝数的快速检测提供了有效方法。

50、第二方面，本发明提供了一种转基因作物目的基因拷贝数检测试剂盒，所述转基因作物目的基因为gat-ms，所述转基因作物目的基因拷贝数检测试剂盒包括核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示的共用引物对。

51、优选的，所述转基因作物目的基因拷贝数检测试剂盒还包括dna聚合酶、dntps、pcrbuffer和dna饱和性染料。

52、进一步优选的，所述dna饱和性染料选自sybr green、evagreen、lcgreen@plus、resolight、syto9中的任意一种。

53、利用本发明提供的试剂盒进行转基因作物目的基因(gat-ms)拷贝数的检测，具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。

54、有益效果：

55、发明提供了一种转基因作物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒。所述方法首次利用实时荧光定量pcr熔解曲线法进行转基因作物目的基因拷贝数的检测。具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。