重组酿酒酵母利用阿魏酸生产高圣草酚的应用

本发明涉及生物，特别涉及重组酿酒酵母利用阿魏酸生产高圣草酚的应用。

背景技术：

1、黄酮是一种广泛存在于植物中的营养物质，具有许多健康保健作用。与非氧甲基化黄酮相比，氧甲基化黄酮具有更好的生物活性和药理特性。高圣草酚是一种存在于北美圣草中的高价值的氧甲基化黄酮化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌等作用。更重要的是，高圣草酚及其衍生物可以显著降低食物或药物的苦味，而不会表现出其自身的强烈味道，二者被作为苦味掩蔽剂广泛地应用于食品及药品工业。因此，实现高圣草酚的可持续供应至关重要。获得高圣草酚的传统方法包括植物提取和化学合成。然而，植物的季节性及区域性导致植物提取方法并不实用。受到有毒试剂及极端反应条件的限制，化学合成方法的安全性无法保证。近几年来，微生物生产高圣草酚的方法因其工艺周期短、效率高、环境友好等优点而受到广泛的关注。

2、先前的研究在大肠杆菌中构建了从阿魏酸出发生产高圣草酚生物合成途径(图1)。阿魏酸是一种甲基化苯丙酸。大多数4-对香豆酰辅酶a连接酶(4-coumarate-coaligase：4cl)和查尔酮合酶(chalcone synthase：chs)并不能将甲基化的苯丙酸及其对应的辅酶a作为底物，但几种来源于植物且具有广泛特异性的4cl和chs可以发挥这一功能。现有技术公开了一株含有来自水稻的4cl及来自大麦的chs的工程大肠杆菌，用于利用阿魏酸合成高圣草酚，该工作的高圣草酚产量为52mg/l，转化率为17.2％。现有技术公开了含有来自葡萄的4cl、来自拟南芥的chs及来自拟南芥的查尔酮异构酶(chalcone isomerase：chi)的工程大肠杆菌，以甘油为碳源，以阿魏酸作为中间产物合成高圣草酚，该工作的高圣草酚产量为17mg/l。

3、目前已报道过的有关高圣草酚的微生物生产都局限以大肠杆菌作为底盘菌进行改造，尚未有有关在酿酒酵母中生产高圣草酚的报道。因此，提供能够利用阿魏酸生产高圣草酚的工程酿酒酵母具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供的菌株及其应用，能够利用阿魏酸生产高圣草酚，相比现有技术具有更高的产率及转化率。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了基因工程改造在提高微生物将底物转化为高圣草酚的转化率中的应用；

4、所述基因工程改造为：

5、(i)、添加来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因；

6、所述基因工程改造还包括：

7、(ii)、添加来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；和

8、(iii)、添加来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因；

9、所述微生物包括大肠杆菌和/或酵母；

10、所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d；

11、所述底物包括阿魏酸。

12、本发明还提供了基因元件，包括：

13、(i)、基因元件1；或

14、(ii)、基因元件1、基因元件2和基因元件3；

15、所述基因元件1具有来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因；

16、所述基因元件2具有来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；

17、所述基因元件3具有来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因。

18、在本发明的一些具体实施方案中，上述基因元件包括：

19、所述来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因序列包括：

20、(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或

21、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或

22、(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

23、所述来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因序列包括：

24、(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或

25、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或

26、(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

27、所述来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因序列包括：

28、(7)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或

29、(8)、如(7)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(7)的相同或相似；或

30、(9)、与如(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

31、所述多个为2个至160个。

32、本发明还提供了表达盒，包括：

33、(i)、表达盒1；或

34、(ii)、表达盒1、表达盒2和表达盒3；

35、所述表达盒1包括启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件1；

36、所述表达盒2包括启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件2；

37、所述表达盒3包括启动子、终止子和上述基因元件中的所述基因元件3；

38、所述启动子包括ptpi1、ptef1或pgpm1；

39、所述终止子包括tcps1、ttef2或tadh1。

40、本发明还提供了表达载体，具有：

41、(10)、如seq id no:4所示的核苷酸序列；或

42、(11)、如(10)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(10)的相同或相似；或

43、(12)、与如(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；

44、所述多个为2个至1000个。

45、本发明还提供了表达载体，包括cas9编码基因、绿色荧光蛋白编码基因、his3编码基因、卡那霉素编码基因和grna，以及可接受的基因元件。

46、本发明还提供了表达系统，包括上述表达载体、linker和如下任一项：

47、(a)、上述基因元件；或

48、(b)、上述表达盒。

49、本发明还提供了宿主细胞，包括如下任一项：

50、(a)、上述基因元件；

51、(b)、上述表达盒；

52、(c)、上述表达系统；

53、所述宿主细胞包括酵母；

54、所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d。

55、本发明还提供了酿酒酵母cen.pk2-1d的重组菌株，包括添加来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因。

56、在本发明的一些具体实施方案中，上述重组菌株还包括：

57、添加来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因；和

58、添加来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因。

59、本发明还提供了组合物，包括阿魏酸和如下任一项：

60、(e)、上述宿主细胞；或

61、(f)、上述重组菌株。

62、本发明还提供了高圣草酚的制备方法，包括：

63、(a)、将上述基因元件整合至酵母的基因组，然后与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或

64、(b)、取上述表达盒整合至酵母的基因组，然后与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或

65、(c)、取上述表达系统导入酵母，再与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或

66、(d)、取上述宿主细胞或上述重组菌株与阿魏酸混合，发酵，获得所述高圣草酚；或

67、(e)、培养上述组合物，获得所述高圣草酚；

68、所述酵母包括酿酒酵母cen.pk2-1d。

69、在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于欧芹的对香豆酰辅酶a连接酶4cl的基因在酵母中的插入位点为delta15。

70、在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于青稞的查尔酮合酶chs的基因在酵母中的插入位点为delta15。

71、在本发明中的一些具体实施方案中，所述来源于青稞的查尔酮异构酶chi的基因在酵母中的插入位点为delta15。

72、本发明的菌株及其应用有如下效果：

73、实验表明，用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基ypd进行摇瓶发酵，初始od600＝0.1，在0h补加0.26mmol/l的阿魏酸，30℃，220rpm摇床中培养72h，高圣草酚的产量为0.04mmol/l，得率为28.6％。现有技术可以在大肠杆菌以阿魏酸为底物生产高圣草酚，得率为17.2％。该得率较低。本发明首次利用酿酒酵母从阿魏酸生产高圣草酚，相比之下，得率较现有技术高66.3％。