基于IGF2降解细胞膜表面或细胞膜外蛋白的方法及融合蛋白

(一)本发明涉及一种基于igf2降解细胞膜表面或细胞膜外蛋白的方法及融合蛋白。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras,protac)利用真核细胞中泛素-蛋白酶体降解系统的工作原理，通过小分子药物将靶标蛋白泛素化从而进入蛋白酶体中降解，是目前药物开发领域的热点，然而这种方法适用于细胞质中的蛋白或具有细胞质面亲水结构域的膜蛋白。然而，近40％的基因编码的蛋白属于细胞外和膜相关蛋白，它们在细胞与外部环境进行物质交换和信号传递过程中发挥重要作用，其稳态失衡引起一系列严重疾病，包括神经退行性疾病、2型糖尿病和癌症等，因此细胞外和膜相关蛋白也一直以来都是创新药研发的主要靶点。

2、2020年，诺贝尔奖得主bertozzi课题组首次报道了利用溶酶体途径降解细胞外、膜相关蛋白，称为溶酶体靶向嵌合体(lysosome-targeting chimeras,lytacs)。该技术通过将细胞膜上表达的阳离子-非依赖甘露糖-6-磷酸受体(ci-m6pr，又名igf2r)的聚糖配体m6pn修饰胞外靶标蛋白的抑制剂，利用受体介导的内吞作用引起靶蛋白的内化，从而诱导靶蛋白在溶酶体中降解，提高抑制剂的效果。然而，lytacs技术的不足主要是聚糖分子量大、合成困难，且可能诱导免疫反应。随后，基于易合成的寡核苷酸适配体、细胞因子的双特异性抗体等手段的开发，使得胞外蛋白质降解领域取得了显著的进展，然而适配体的体内稳定性、抗体工程的复杂度仍有待改善。

3、lytacs分子是将甘露糖-6-磷酸受体的聚糖配体与胞外蛋白靶标结合的分子(通常为抗体)通过化学方式连接，偶联修饰位点不均一导致抗体载荷异质性，同时m6pn可能诱导免疫反应，糖基配体化学合成复杂(15步、<10％产率)，这一系列问题也意味着亟需开发简单易得、同质性高、稳定性高的lytacs新工具。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种基于igf2(胰岛素样生长因子2)降解细胞膜表面或细胞膜外蛋白的方法及融合蛋白，本发明首先借助igf2独特的性质(多肽、与igf2r结合内吞等性质)，将igf2与细胞表面靶标蛋白(membrane target)、细胞外靶标蛋白(extracellulartarget)通过结合分子(target binder)(如亲和体(affibody)、纳米抗体(nanobody)等小分子工程蛋白)进行融合，得到融合蛋白ilytacs；其次，借助融合蛋白ilytacs的igf2与细胞表面的溶酶体靶向受体igf2r的结合，形成三元复合物(target/ilytacs/igf2r)；最后通过三元复合物将靶蛋白内吞进入溶酶体中，从而实现靶标蛋白的降解。同时，本发明方法构建的融合蛋白可在大肠杆菌中高表达、性质稳定，对靶蛋白降解效率高，并且大大简化了lytac系统的构建复杂度，提高了均一性，且打开了融合蛋白在药物开发中的应用新格局。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种基于igf2降解细胞膜表面或细胞膜外蛋白的方法，所述方法是将igf2与细胞膜表面或细胞膜外靶蛋白的结合分子融合形成融合蛋白；再将融合蛋白与细胞共培养，利用融合蛋白的igf2与细胞表面的溶酶体靶向受体igf2r的结合，将靶蛋白内吞进入溶酶体中，从而实现细胞膜表面或细胞膜外靶标蛋白的降解。

4、优选的，所述靶蛋白的结合分子包括亲和体、纳米抗体。

5、优选的，所述细胞包括人宫颈癌细胞hela、人乳腺癌mda-mb231或人神经母细胞瘤sh-sy5y。

6、优选的，所述靶蛋白包括表皮生长因子受体蛋白egfr、细胞程序性死亡配体1(pd-l1)或膜外蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein)。

7、优选的，所述融合蛋白氨基酸序列如seq id no.1(记为igf2-afegfr)、seq idno.3(记为igf2-afsyn)、seq id no.5(记为igf2-nbpdl1)之一所示。

8、本发明提供一种所述方法构建的融合蛋白，所述融合蛋白是由igf2蛋白与细胞表面或细胞外的靶蛋白的结合分子融合而成，所述靶蛋白包括表皮生长因子受体蛋白egfr、细胞程序性死亡配体1(pd-l1)或膜外蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein)；所述靶蛋白的结合分子包括亲和体、纳米抗体；所述融合蛋白氨基酸序列如seq id no.1(记为igf2-afegfr)、seq id no.3(记为igf2-afsyn)、seq id no.5(记为igf2-nbpdl1)之一所示。

9、本发明还提供一种所述融合蛋白的制备方法，所述方法为：(1)将所述融合蛋白的dna序列构建在pet-24a(+)载体上，采用“化学转化法”转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，挑取单克隆进行lb液体培养，当处于对数生长期(od600＝0.6-0.8)时加入诱导剂iptg至终浓度0.5mm，继续37℃培养4-5小时后收集菌体；(2)在150ml菌体中加入15ml裂解缓冲液(20mm磷酸盐缓冲液、8m尿素、300mm nacl、3mm二硫苏糖醇(dtt)，ph 7.8)，将菌体充分悬浮，室温静置1小时，12000rpm离心20分钟，收集上清，即为蛋白粗酶液；(3)将蛋白粗酶液加入ni-nta agarose(qiagen，用1ml pbs溶液置换3次)，ni-nta agarose的加入体积根据ni-nta agarose的蛋白质负载为50mg/ml计算；加入ni-nta agarose的上述蛋白粗酶液置于4℃缓慢旋转，使ni-nta agarose充分与目的蛋白结合，1小时后取出，用重力法纯化目的蛋白，洗脱液分别是buffer 1：20mm磷酸盐缓冲液、8m尿素、300mm nacl，ph 7.8；buffer 2：20mm磷酸盐缓冲液、8m尿素、300mm nacl，ph 6.0；buffer 3：20mm磷酸盐缓冲液、8m尿素、300mm nacl，ph 4.0；每种缓冲液洗脱10倍柱体积将蛋白质洗脱下来，收集buffer 3的全部流出液，获得融合蛋白的纯蛋白液。

10、本发明所述igf2是一单链多肽类调控因子，与胰岛素结构相似，也称为生长调节素，分子量约7.5kd，在细胞增殖、分化等过程中起着重要作用。

11、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

12、本发明以igf2为配体与细胞表面或细胞外靶蛋白特定的亲和体、纳米抗体融合，通过融合蛋白的igf2与细胞表面的溶酶体靶向受体igf2r介导的内吞作用，可以快速降解细胞表面或细胞外靶标蛋白，12小时处理可以降解58％的表皮生长因子受体蛋白egfr，进一步提升了靶标蛋白配体(target binder)的抑制效率，同时展示了在靶向生物分子调控方面的范围和潜力。

13、本发明融合蛋白削弱了连接子长度和组成的影响，可以在大肠杆菌中高效表达，产量高。蛋白质成分均一，不易被降解，从而解决了化学连接引起的偶联物异质性和适配体的体内不稳定性难题。相比于第一代lytacs，ilytacs无需多步骤化学合成、可在大肠杆菌中大量、稳定表达、并针对不同靶点可订制、可模块化构建。

14、本发明代表了一种方便和选择性靶向蛋白质降解的通用策略，从而扩大了当前融合蛋白相关技术的在药物开发中的潜在应用。